Farmacologia cellulare e famacogenomica

Farmacogenomica

Proff. Luceri e De Logu

A.A. 2021/2022

Farmacologia cellulare e farmacogenomica

Francesco De Logu

A.A. 2021/2022

Farmacogenetica nello sviluppo di un farmaco – Lez.1

Cerchiamo di andare a indagare quale sia il recettore coinvolto, in particolare una famiglia di recettori, il transient detector potential channel, una famiglia di recettori canali espressi soprattutto nei neuroni sensitivi primari ma svolgono un ruolo primario anche in cellule non neuronali e in particolare abbiamo trovato che sono espresse in tipi di cellule come la cellula di Schwann, una cellula della glia, che in qualche modo permette lo sviluppo e mantenimento di questo dolore. Sono cellule con un ruolo tropico per il nervo favorendo la conduzione nervosa nella cellula mielinizzata, e hanno un ruolo anche nella rigenerazione nervosa.

Possiamo vedere che son cellule che si dividono in cellule mielinizzate non mielinizzate, queste cellule di Schwann dette Remak, vedendo che queste cellule esprimono questi recettori che non solo fanno entrare calcio, ma attivano una cascata di segnali intracellulari che determinano come evento finale aumento dello stress ossidativo che poi bersaglia il neurone primario provocando dolore e lo mantiene nel tempo in certe sindromi dolorose come neuropatie indotte da chemioterapici.

Infatti persone affette da cancro e trattate con questi chemioterapici hanno tanti effetti collaterali come iper-sensibilità a stimoli tattili, a freddo e a caldo e spesso questi dolori da iper-sensibilità sono così accentuate da far sì che il paziente non mantenga questa terapia e si ritrovi a interromperla con tutte le conseguenze, ovvero che non si ha più la possibilità di contrastare il cancro.

In questi ultimi anni si è andati a studiare molto queste cellule, il problema è quello di andare a veicolare il farmaco in modo cellulo specifico; quindi, sappiamo che il farmaco si muove liberamente nell’organismo seguendo i principi della farmacocinetica, ma una volta che viene distribuito agisce in modo indiscriminato anche con effetti off-target.

Lo scopo è allora veicolare un determinato farmaco proprio su quella cellula che vogliamo bersagliare in quel tessuto che ha quella patologia. Allora è stato sviluppato nel tempo una serie di approcci che poi rientrano nel nome di Targeted Therapy, che prevede la possibilità di veicolare questi farmaci solo nel tessuto di interesse.

Questo ad oggi possiamo dividere gli approcci della Targeted Therapy in 4 categorie: si parte dall’Ab monoclonale, che in qualche modo riconosce l’Ag sulla cellula target che vogliamo colpire e quindi agiamo su quel recettore, proteina di membrana, andando o a mascherare l’azione di quel recettore o proteina, oppure andando ad attivare una risposta immunitaria determinandone la distruzione attivando il SI, quindi diciamo attivando un ruolo sia diretto che indiretto dell’Ab, nello specifico monoclonale.

Un altro metodo invece è quello di andare a costruire delle proteine chimeriche che da un lato fungono da substrato per un recettore, dall’altra parte sono collegati e legati con strutture che svolgono poi dopo quello che vogliamo far svolgere alla molecola, quindi sia con scopo diagnostico, per esempio allegandovi una sostanza radioattiva seguibile nell’individuo, oppure anche un altro farmaco come cargo che agisce sulla cellula target riconosciuta dal mAb.

Approcci pre-clinici e vettori virali

Tornando al caso della cellula Remak di Schwann, per riuscire a bersagliare questa cellula, nel neurone sensitivo primario, utilizziamo approcci diversi, uno prevalentemente pre-clinico usando dei topi che da un lato, una linea, esprime il gene che vogliamo eliminare e che è fiancheggiato da sequenze dette LoxP, ed è una mutazione indotta nella linea germinale e quindi sviluppiamo topi che esprimono in omozigosi questo gene fiancheggiato da due sequenze LoxP una al 3’ e una al 5’.

Dall’altra parte abbiamo un’altra linea germinale che sono topi sempre transgenici ma che esprimono un enzima detto Cre che viene espresso invece in modo cellula-specifica; quindi, o nel neurone sensitivo primario e basta, oppure a livello delle cellule della glia del sistema periferico, nelle cellule di Schwann.

Allora quando noi andiamo a fare incrociare questi due topi, otteniamo che l’enzima Cre presente nelle cellule di Schwann taglia in corrispondenza delle LoxP, ma facendolo solo in quella cellula in cui Cre è espresso. Quindi avremo una progenie in cui solo in queste cellule avremo tagliato il gene di interesse, ovviamente è un approccio solo pre-clinico, non possiamo farlo nell’uomo accoppiando soggetti Cre e soggetti LoxP.

Allora dobbiamo ingegnarsi per veicolare questi farmaci o mutazioni a livello delle cellule di nostro interesse. Allora abbiamo sviluppato una serie di strategie con vettori virali, ovvero nello specifico vettori lentivirali oppure anche adeno-associati, che permettono di veicolare un determinato elemento, che sia un RNA, piuttosto che un gene per fare Knock In, per andare a infettare questi topi per andare a evidenziare e regolare l’espressione di un gene di interesse nella cellula bersaglio.

Questo è quello che andremo a vedere, ci sarà una parte sui farmaci peptidici, quelli basati su ribonucleotidi, su Ab e frammenti anticorpali, terapia genica basata su vettori virali e no, e poi invece ora una parte più iniziale sulla farmacogenetica.

Farmacogenetica e sviluppo del farmaco

Si parla quindi della farmacogenetica e dello sviluppo del farmaco. Intanto vediamo la differenza tra farmacogenetica e farmacogenomica, dove per nessuno dei due abbiamo realmente una definizione chiara e precisa, diciamo che non c’è nessuna grande differenza. La farmacogenetica si usa tipicamente per definire come una determinata modifica genica influenza una risposta a un farmaco, sappiamo che non tutti reagiamo ai farmaci allo stesso modo con specifici trattamenti e non sappiamo sempre perché, ma quando lo sappiamo spesso è dovuto a questi motivi genetici.

Questo lo possiamo quindi usare a nostro vantaggio nel fare degli screening genetici per definire per ogni singolo paziente una terapia piuttosto che un’altra. Un esempio è l’uso dell’Ab monoclonale per il CGRP però è un farmaco molto importante e molto funzionante contro l’emicrania e i pazienti che soffrono con altissima frequenza di attacchi di emicrania, con questa terapia trovano un enorme beneficio con una riduzione dell’80-90% degli attacchi totali precedenti al trattamento con il mAb. Il problema è che non sappiamo perché il 20-30% dei soggetti a livello mondiale non rispondono a questo trattamento.

Quindi, ovviamente la farmacogenetica nasce anche di pari passo con il progetto genoma umano e quindi con la conoscenza del genoma nella sua interezza possiamo confrontare quali sono le porzioni mutate rispetto a quelle non mutate. Le mutazioni principali che agiscono sull’esito di una terapia sono di solito più che il bersaglio del farmaco (farmacodinamica), interessano soprattutto la farmacocinetica del farmaco; quindi, in enzimi che riguardano il metabolismo del farmaco, determinano aumento o riduzione del metabolismo del farmaco, incidendo allora notevolmente con la farmacocinetica del farmaco.

Infatti se lo metabolizzo in modo rapido, lo ritrovo in quantità minori in circolo e quindi avrò una riduzione della emivita e dell’azione del farmaco, richiedendo allora un aumento della dose somministrata. D’altra parte invece posso avere l’opposto, se ho un lento metabolizzatore avrò una quantità di farmaco che mi rimane in circolo in forma attiva più tempo dando effetti opposti. Ovviamente in termini di effetti dipende da che farmaco sto considerando, ovvero se parlo di un profarmaco che per essere attivato deve essere metabolizzato, in questo caso ovviamente il metabolizzatore rapido ha in circolo una concentrazione di farmaco efficace più rapidamente rispetto al metabolizzatore lento.

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Importante quindi poter dire che con la farmacogenetica abbiamo un approccio che potremmo chiamare a posteriori, ovvero per esempio abbiamo una determinata parte della popolazione che risponde bene a un trattamento e l’altra parte che invece non risponde bene, proprio perché vengono usati questi farmaci e sulla base delle risposte andiamo a valutare i genotipi per vedere le differenze tra gli individui risponder e non risponder.

D’altra parte invece con la farmacogenomica abbiamo ci permette di usare quell’approccio a priori, per cui ci permette di fare uno screening genomico dell’individuo; quindi, andiamo a vedere un gene che sappiamo essere eventualmente soggetto a una mutazione che inficia nell’attività di un farmaco, a quel punto allora andiamo a cercare la mutazione e in base all’identificazione o meno andremo a agire sulla terapia e sulla dose.

Quindi potremmo allora dire che la farmacogenetica è lo studio di come le variazioni genetiche agiscono sulla disposizione del farmaco, comprendendo il loro metabolismo, trasporto, efficacia e la loro safety.

Obiettivi della farmacogenetica o genomica

Allora gli obiettivi della farmacogenetica o genomica sono di:

• Massimizzare l’efficacia del farmaco;
• Minimizzare la tossicità del farmaco, in questo caso se so che un individuo è un rapido metabolizzatore so che produce una quantità di metaboliti più o meno tossici in un determinato lasso di tempo, tanto da indurre effetti collaterali importanti, allora riduco la dose, e andrò a effettuare somministrazioni inferiori ma maggiori in termini di frequenza nel tempo, mantenendo quindi bassa la tossicità;
• Predire quali pazienti rispondono nel modo migliore a quel farmaco;
• Sviluppare nuovi farmaci.

Diciamo che la speranza che abbiamo è di andare dal farmacista, sapere quale è la propria sequenza genomica, tale che venga inserita in qualche database che ci dica quali farmaci sono utilizzabili o meno, ovviamente è un po’ un’utopia questa, ma già oggi rispetto al passato è molto più pensabile un approccio simile, grazie soprattutto alle tecniche di screening del genoma molto più facili e fattibili.

Facendo un breve excursus di quando è nata la farmacogenomica/genetica, possiamo dire che già nel 510 a.C. Pitagora scoprì che alcune persone erano soggette a una fatale anemia dopo aver ingerito le fave e si scoprì solo dopo che era dovuto a un difetto della Glucosio-6-fosfato deidrogenasi, la malattia detta favismo, ovvero che se ne aveva una ridotta attività con una riduzione di produzione di NADPH che serve a proteggere i globuli rossi dallo stress ossidativo, quindi allora portava alla distruzione del globulo rosso dovuto a questo eccesso di produzione dello stress ossidativo e quindi i soggetti morivano di emolisi.

Oggi sappiamo benissimo come e dove andare a effettuare gli screening, conoscendo il gene da mappare e anche le mutazioni da cercare.

Farmacogenomica, sviluppo industriale e precisione

La farmacogenomica agisce ovviamente in vari obiettivi, innanzitutto operare sullo sviluppo del farmaco, ovvero l’investimento di un’azienda per un farmaco deve anche essere correlato sulle eventuali mutazioni presenti a livello mondiale per quell’enzima e metabolismo, ovvero se abbiamo il 30% di individui che sono metabolizzatori lenti, 15% intermedi e 55% metabolizzatori rapidi, a quel punto considerando che questa malattia affligge una serie di individui, devo fare una serie di valutazioni economiche e quindi è importante proprio in questo ambito proprio per la scelta dello sviluppo di un farmaco.

Dopodiché la farmacogenetica è importante per aumentare il successo anche nella farmaceutica industriale, quindi c’è anche l’effetto opposto, ovvero vado a sviluppare un determinato farmaco proprio sapendo quali sono quelle mutazioni che possono o meno favorire quel tipo di metabolismo più comune per esempio. Le industrie, quindi, sviluppano farmaci efficaci e sicuri partendo a migliaia di molecole che sono screenate e solo pochissime ottengono quelle condizioni che permettono loro di entrare nel mercato.

Dal 1950 il numero di farmaci approvati dall’FDA e riportati poi con successo sul mercato si riduceva 50% circa ogni 9 anni, la procedura necessaria per portare un farmaco sul mercato partendo dalla sperimentazione clinica fino ad avere i permessi legali richiedeva in media 6/7 anni e solo il 16% dei farmaci che entrano in fase clinica poi entrano anche nel mercato, proprio per i vari problemi che possono avere.

Ecco allora il motivo per cui si vede necessario passare nell’ambito di studi di farmacogenetica, andando quindi a cercare di sviluppare farmaci che possano abbracciare la maggior parte della popolazione mondiale. E spesso oggi osserviamo una trasformazione sia da parte delle industrie che dalle agenzie regolatorie verso un modello di precisione che prevede di trovare il giusto trattamento per il giusto paziente nel giusto momento, in questo modo quindi ci guadagna il paziente che sa che il farmaco gli funzionerà, ma poi ci guadagna anche l’industria perché sa che una volta immesso nel mercato questo farmaco avrà sicuramente una fetta di soggetto che lo useranno.

Un esempio è AstraZeneca che dal 2005 al 2010 aveva una performance nel settore di ricerca e sviluppo sotto la media mondiale, mentre nel 2011 ha deciso di spostare tutta la sua produzione e politica industriale sulle 5 R, ovvero Right target, Right tissue, Right safety, Right patient e Right commercial potential.

Quindi sono tutte condizioni per le quali il farmaco agirà in modo univoco; quindi, su un determinato target escludendo effetti off target, su un determinato tessuto, quindi limitando effetti su tessuti indesiderati, agiscono solo su determinati pazienti e poi ovviamente con la corretta sicurezza e poi non in ultimo anche avere un buon potenziale commerciale di reddito economico. E quindi usando questa strategia la performance è aumentata del 16%.

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Sviluppo di nuovi farmaci

Lo sviluppo di nuovi farmaci prevede sicuramente identificazione e caratterizzazione di nuovi target, poi anche la valutazione e ottimizzazione di farmacocinetica e farmacodinamica, e poi valutazione di efficacia e sicurezza del farmaco. In particolare la fase di identificazione del nuovo target permette di riconoscere il potenziale target del farmaco e caratterizzarlo, ma poi permette anche di andare a vedere un gene che va a produrre quel determinato target di interesse, vedendo se sono presenti o meno mutazioni, e quando sono presenti come agisce quel farmaco, e poi anche vedere la variabilità della risposta del farmaco una volta che colpisce quel target.

Questo quindi permette di eliminare tutte quelle molecole che non sono buone già nelle prime fasi, ma poi permette anche di velocizzare lo sviluppo clinico facilitando il disegno di trials che mostrano più chiaramente l’efficacia o la sicurezza del farmaco, questo perché se so già quale è la popolazione target, ovviamente il mio trials esegue avanzamenti molto rapidi, quindi non devo agire per esempio considerando tutta la popolazione testando il farmaco per poi per esempio arrivare a vedere che agisce solo su 15% della popolazione, necessitando quindi un loro screening paragonando questi genotipi con il restante 75% e così via.

Quindi questo permette proprio di far avere ai pazienti un farmaco molto più velocemente, ma anche più sicuro e performante, mentre per l’industria permette anche di ottenere una riduzione di costi notevole. In tutto questo, infatti, poi è con la progressione del progetto genoma umano che sono nate anche nuove tecnologie che hanno servito al progetto genoma umano stesso, ma poi anche per questi motivi citati alle varie industrie farmacologiche, di avere enormi sviluppi, nel progetto genoma umano nello specifico di arrivare a mappare tutto il genoma umano.

È grazie a tutte queste tecnologie che dal 2008 al 2014 la mappatura completa del genoma umano è passata dal costo di 10 milioni di dollari a soltanto 1000 dollari. Insieme poi al progetto genoma umano sono nati tanti altri progetti, sempre importanti per farmacogenomica e farmacogenetica, in particolare progetti come detti come International HapMap Project, ma anche The 1000 Genome Project e Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) e in ogni caso creano librerie fondamentali su cui si sviluppano varie cose, tra cui anche lo sviluppo del farmaco e farmaci che prendono in considerazione la farmacogenomica, quindi le mutazioni dell’individuo.

Fase pre-clinica e tossicogenomica

A livello pre-clinico invece si studia la tossicità di un farmaco usando dei bio-marker per capire se è sicuro o meno e questo facilita la scelta del farmaco, e questo facilita in qualche modo la scelta del farmaco e spesso questi studi di fase pre-clinica sono fatti su roditori, ma non sempre. Infatti intanto non tutti i modelli sono uguali tra loro, ma soprattutto anche i modelli di roditore stesso poi non sono uguali tra loro, per esempio banalmente per i farmaci attivi contro il dolore abbiamo dei topolini che sono il tool spesso più efficiente per la ricerca preclinica perché tutti i vari modelli transgenici sono sempre su topo e raramente ci sono altri animali transgenici per determinati recettori o proteine.

Però è anche vero che per alcune patologie i topi non sono adatti, per esempio la cavia è importantissima per gli studi della tosse perché è l’unico tipo di roditore che effettivamente tossisce; quindi, non posso usare ratti o topi perché non tossiscono. Mentre le cavie albine sono gli unici animali che si inseriscono in camere di conta di tosse e quindi possiamo usare un fattore che scatena la tosse come un aerosol di acido citrico, e quindi queste cavie tossiscono e si testano i vari farmaci antitussivi in relazione a farmaci di controllo spesso.

Per esempio per gli antiemetici invece si usa il gerbillo, unico animale che ha efficacia per riprodurre la situazione umana. E quindi la ricerca pre-clinica facilita la ricerca di dati dell’uomo riducendo il costo e la probabilità di fallimento; infatti, poi è difficilissimo che uno studio clinico possa esserci senza uno studio preclinico solido precedente.

Nasce quindi in questo modo anche quella che si chiama tossicogenomica che cerca di definire il profilo tossicogenomico mediante DNA macroarray per capire quei meccanismi della patologia e anche gli effetti di un trattamento farmacologico, ovvero andiamo a valutare l’ibridazione di cDNA derivanti da retrotrascrizione di mRNA sottoposti all’azione del farmaco; perciò, vediamo se quel farmaco agisce co