Virologia per l'esame di Microbiologia

Virologia generale

I virus non sono dei microorganismi e non hanno autonomia propria. Non possono riprodursi e non hanno un metabolismo proprio, ma sono particelle in grado di sfruttare i meccanismi metabolici di un’altra cellula che infetta. Il virus è un’entità biologica con un’organizzazione subcellulare costituita da una combinazione di macromolecole che sono un acido nucleico (DNA o RNA), un involucro proteico di origine virale e, talvolta, una matrice fosfolipidica che proviene dalla cellula infettata dal virus. Il virus è caratterizzato da semplicità strutturale e non ha una vita propria, quindi deve necessariamente riprodursi all’interno di cellule viventi poiché sono parassiti intracellulari obbligati.

Differenze tra virus e microorganismi procarioti

I virus non hanno la presenza contemporanea di DNA e RNA, a differenza dei batteri. Non hanno ribosomi né possiedono una struttura che possa essere riconducibile a una cellula. Inoltre, non hanno capacità biosintetiche autonome e non sono sensibili agli antibatterici, quindi gli antibiotici non funzionano. Non possiedono sistemi enzimatici per la produzione di energia e non possono crescere al di fuori di cellule vive, in terreni artificiali.

Dimensioni dei virus

Sono di dimensioni molto piccole, inferiori a quelle dei batteri e non visibili al microscopio ottico (risoluzione 0,2 micron). I virus si collocano in un range tra 10^-6 e 10^-9 m, quindi è necessario utilizzare il microscopio elettronico.

Morfologia

Nella porzione centrale hanno un acido nucleico, DNA o RNA. Intorno al genoma c’è un involucro proteico chiamato capside. Il genoma e il capside, insieme, prendono il nome di nucleo-capside. Alcuni virus presentano un ulteriore involucro lipoproteico chiamato pericapside o envelope, al cui interno possono essere inserite delle glicoproteine. A seconda della presenza o assenza di pericapside, si distinguono delle famiglie di:

• Virus nudi: non hanno il pericapside
• Virus rivestiti: hanno il pericapside

Il capside è costituito da una serie di subunità proteiche dette capsomeri, disposti in maniera geometrica con strutture di tipo cubico-icosaedrico o elicoidale. Il capside cubico-icosaedrico ha la morfologia dell’icosaedro con 20 facce triangolari, ciascuna composta da 6 subunità (esoni/esameri) e 12 vertici, con 5 subunità (pentoni/pentameri). Il capside elicoidale ha subunità proteiche che decorrono lungo tutto l’acido nucleico attorcigliato su se stesso.

Proteine

Il capside del virus è di natura proteica. La capacità codificante del genoma è limitata perché l’acido nucleico non è grande e le proteine sono perlopiù ripetitive. La capacità sintetica del genoma viene ottimizzata. Tra le proteine codificate dal genoma si distinguono due categorie:

• Proteine strutturali: fanno parte della struttura fisica della particella virale
• Proteine non-strutturali: non rientrano nella costituzione strutturale del virus, ma hanno funzioni biologiche

Le proteine sono importanti per l’adsorbimento e l'attacco del virus alla cellula che va a infettare. Sono importanti anche per la configurazione delle caratteristiche antigeniche.

Acido nucleico

All’interno del capside è presente il genoma del virus, che può essere DNA o RNA, singolo o doppio filamento, segmentato o non segmentato.

Virus a RNA

Sono quasi tutti a singola elica (ad eccezione della famiglia Reoviridae). A parte i Retrovirus, sono tutti aploidi. Il filamento di acido nucleico può essere lineare o circolare, segmentato oppure no, a polarità positiva o negativa. La polarità positiva significa che l’acido nucleico viene direttamente letto come mRNA dai ribosomi della cellula ospite; polarità negativa significa che l’acido nucleico funge da stampo per generare un mRNA.

Esiste un enzima virale detto RNA polimerasi RNA-dipendente che, sullo stampo di un RNA a polarità negativa, sintetizza un mRNA. È un enzima poco accurato che fa molti errori di trascrizione, portando a un’elevata frequenza di mutazioni e variabilità dei virus a RNA rispetto a quelli a DNA.

Virus a DNA

Sono tutti double stranded, tranne la famiglia Parvoviridae. Hanno tutti genoma aploide, lineare o circolare, con dimensioni variabili. Nella fase replicativa si utilizza un enzima di derivazione cellulare, la DNA polimerasi, un enzima preciso con attività di proofreading. I virus a DNA sono poco variabili.

Lipidi

L’involucro esterno (pericapside) ha una componente lipidica che permette che i virus rivestiti siano inattivati dai solventi dei grassi come etere e cloroformio. L’envelope viene acquisito dalla membrana citoplasmatica o nucleare della cellula infettata, avendo costituenti che non sono propri dei virus.

Glicidi

All’interno della struttura del virus si trovano componenti glucidiche come i pentosi degli acidi nucleici e le glicoproteine del pericapside. Tra queste ultime ci sono proteine importanti come emoagglutinina e neuraminidasi.

Terminologia

• Core: acido nucleico + molecole che lo stabilizzano
• Capside: struttura proteica che racchiude acido nucleico/core
• Capsomero: unità proteica che forma il capside
• Nucleocapside: acido nucleico + capside
• Envelope: involucro lipoproteico esterno
• Peplomeri: proiezioni superficiali che protrudono dall’envelope
• Virione: particella virale completa, come si può osservare al di fuori della cellula

Classificazione di Baltimore

I virus sono classificati in 7 gruppi in base alle caratteristiche del genoma e alle modalità di replicazione. I gruppi sono:

• ssDNA
• dsDNA
• dsRNA
• ssRNA+
• ssRNA-
• ssRNA (RT) ha caratteristiche di retrotrascrizione
• dsDNA (RT) ha caratteristiche di retrotrascrizione

Il focus è su come si arriva all’evento trascrittivo, all’mRNA.

Principali virus a DNA

Tra i principali virus a DNA si trovano: parvovirus, hepadnavirus, papovavirus, adenovirus, herpesvirus, poxvirus. Un esempio di virus a DNA è l’adenovirus con struttura icosaedrica e protrusioni che corrispondono a glicoproteine.

Principali virus a RNA

Tra i principali virus a RNA ci sono: picornavirus, astrovirus, calicivirus, flavivirus, togavirus, coronavirus, retrovirus, reovirus, bunyavirus, ortomixovirus, arenavirus, filovirus, rabdovirus, paramixovirus.

Replicazione virale

La replicazione virale parte dall’infezione di una cellula, poi si ha la produzione di una progenie di particelle virali a partire da quella originaria, che usciranno dalla cellula infettata e ripeteranno questo percorso in altre cellule. La replicazione si semplifica con una serie di passaggi:

• Adsorbimento: ancoraggio del virus alla cellula. Avviene tra degli antirecettori virali e dei recettori cellulari sulla cellula da infettare, comportando il riconoscimento e il legame tra antirecettore e recettore. Alcuni virus riconoscono più recettori presenti sulla cellula, che prendono il nome di co-recettori. Le caratteristiche di questo legame determinano i tipi di cellule che il virus potrà infettare (tropismo cellulare). La sensibilità della cellula all’infezione è determinata dall’essere un certo tipo cellulare.
• Penetrazione: ingresso del virus nella cellula. Può avvenire attraverso varie modalità:
  • Traslocazione: l’intero virione trasloca e oltrepassa la membrana citoplasmatica
  • Endocitosi: introflessione della membrana cellulare con formazione di un vacuolo all’interno del quale si trova la particella virale
  • Fusione: l’envelope si fonde con la membrana cellulare e permette al virus di infettare
• Scapsidazione: rimozione del capside e rilascio del materiale genetico che si trova solitamente all’interno. Entrano in gioco enzimi lisosomiali e proteasi che demoliscono il capside liberando il genoma. La particella virale non è più presente, si ha la fase di eclisse perché non è più identificabile il virus.
• Sintesi: duplicazione del genoma del virus e sintesi delle costituenti. Entra in gioco il genoma virale, che codifica per la produzione di proteine virali strutturali e funzionali, e replica se stesso per diventare genoma della nuova progenie virale. Questi eventi avvengono nel citoplasma per i virus a RNA e nel nucleo per i virus a DNA. Per la sintesi proteica è necessario l’mRNA virale e l’utilizzo degli apparati sintetici della cellula:
  • I virus a DNA sfruttano l’enzima trascrittasi inversa della cellula
  • I virus a RNA possiedono enzimi propri per la trascrizione
• Maturazione e liberazione: formazione di una nuova progenie virale, maturazione della nuova particella, liberazione di particelle che andranno a infettare altre cellule e ripeteranno il percorso. Nel passaggio a virus rivestiti c’è un passaggio in più: si acquisisce l’envelope a livello della membrana citoplasmatica, il nucelocapside si riforma e i virioni si liberano per gemmazione.

Classificazione dei virus in base al materiale genetico

Il ruolo centrale nella sintesi del materiale virale è l’mRNA. Le classi replicative sono distinte in base al tipo di acido nucleico e alle modalità per cui si attua la trascrizione in mRNA.

• Classe I dsDNA e II ssDNA: Nei virus a DNA la trascrizione avviene ad opera di RNA-polimerasi-DNA-dipendenti di origine cellulare, all’interno del nucleo. In alcuni virus entrano in gioco altri enzimi e la replicazione è citoplasmatica.
• Classe III dsRNA, bicatenario segmentato: Sfrutta una RNA trascrittasi di origine virale e la sintesi dell’RNA avviene una per segmento.
• Classe IV ssRNA+: RNA a singola elica e polarità positiva funge esso stesso da mRNA, permettendo un passaggio diretto alla traduzione in una lunga proteina.
• Classe V ssRNA-: RNA a singola elica e polarità negativa che, grazie alla RNA polimerasi virus-specifica, sintetizza l’mRNA a partire dallo stampo dell’RNA a polarità negativa. Il genoma funge da stampo per trascrizione e replicazione e può essere monocatenario, segmentato, o segmentato ambisenso, con polarità + o –.
• Classe VI Retrovirus: L’RNA è positivo e diploide, possiedono una trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNA dipendente, che sintetizza DNA a partire dall’RNA). Si forma un provirus che si integra nel genoma cellulare e verrà retrotrascritto con produzione di nuove molecole di RNA genomico.

Sensibilità e permissività

Una cellula sensibile è una cellula che presenta recettori e co-recettori specifici e viene infettata da un determinato virus con certi antirecettori. Una cellula permissiva è una cellula che, grazie al proprio apparato biosintetico, consente una completa trascrizione del genoma e sintesi di tutte le proteine del virus al suo interno, permettendo un ciclo replicativo completo. Se una cellula non è idonea alla replicazione del virus, si ha infezione abortiva. Alcuni virus, oltre ad avere un determinato tropismo, sono in grado di infettare le cellule solo in particolari fasi del ciclo cellulare, si parla di infezione ristretta.

Effetti della replicazione virale sulla cellula ospite

La cellula infettata dal virus va incontro a modificazioni morfologiche e biologiche.

• Alterazioni morfologiche: effetto citopatico
  • Arrotondamento
  • Formazione di sincizi: canali che permettono un collegamento di diverse cellule insieme
  • Formazione di inclusioni nel nucleo o nel citoplasma: corpi inclusi, hanno diversi nomi a seconda della morfologia e altre caratteristiche
• Alterazioni biochimiche: sintesi di macromolecole cellulari
• Alterazioni nella composizione antigenica di superficie cellulare: alcune strutture possono essere riconosciute da effettori di risposte immuno-specifiche
• Alterazioni nel controllo della proliferazione cellulare: possibile interferenza con meccanismi di apoptosi e autofagia, immortalizzazione e trasformazione neoplastica.

Genetica dei virus

I virus hanno un tempo di replicazione breve, tra 12-48 ore. Ciascuna cellula viene infettata da molte particelle virali, e la progenie ha modo di amplificarsi. I tassi di errori durante la replicazione sono limitati nei virus a DNA, in cui si usa una DNA polimerasi DNA dipendente. Nei virus a RNA il tasso di errore è più elevato, poiché si usa una RNA/DNA polimerasi RNA dipendente.

Le mutazioni rappresentano per i virus un metodo di adattamento a diverse situazioni, favorite da una selezione positiva se il virus acquisisce un vantaggio, e sfavorite da una selezione negativa se il virus diventa più riconoscibile dalle cellule immunitarie. Le mutazioni puntiformi sono eventi genetici responsabili di alterazioni ereditarie delle caratteristiche virali, dovute ad errori nell’incorporazione di un nucleotide. Esse possono essere spontanee o causate da agenti mutageni. Le mutazioni vengono trasmesse alla progenie e avvengono durante la sintesi del genoma, dipendendo dall’accuratezza dell’enzima replicativo. I virus a ssRNA hanno probabilità maggiori di acquisire mutazioni mentre quelli a DNA ne hanno meno probabilità.

Nomenclatura virale e caratteristiche

I virus vengono distinti in due macrotipologie:

• Virus WILD-TYPE: la variante più frequente in natura di quel virus, con una sequenza nucleotidica detta sequenza consensus
• Virus MUTANTI: derivano dai Wild-type

La mutazione è evoluzione e ci si può trovare in condizioni diverse:

• Alto tasso di mutazione con molti errori: la fitness cala e si arriva all’estinzione
• Basso tasso di mutazione con pochi errori: riconoscimento immune e clearance virale, i virus vengono eliminati

Non è favorevole né un alto né un basso tasso di mutazione; la condizione ottimale è una via di mezzo.

Mutanti virali di interesse medico

• Mutanti più virulenti: determinano malattia più severa e sono più patogeni, possono infettare distretti che solitamente non sono interessati
• Mutanti attenuanti: minore patogenicità, ma buona antigenicità; usati per fabbricare vaccini
• Mutanti farmaco-resistenti: resistenti agli antivirali, ma possono essere meno virulenti del virus originario

Interazioni genetiche dei virus

Se ci sono due virus che coesistono, si possono verificare situazioni diverse. Possono originarsi ceppi virali nuovi dalla coesistenza di virus simili che appartengono ad una stessa specie o famiglia. Queste interazioni possono essere:

• Ricombinazione: due virus diversi che infettano la stessa cellula si scambiano segmenti di acidi nucleici, generando una progenie diversa da quella originaria
• Riattivazione crociata: due virus della stessa specie con alcune caratteristiche diverse, uno attivo e uno inattivo, durante lo scambio diventano attivi entrambi
• Riattivazione da molteplicità di infezione: genomi di virus tutti inattivi ma per porzioni diverse di genoma si trovano tutti nella stessa cellula e si scambiano segmenti di genoma, attivandosi tutti

Possono esserci anche interazioni non genetiche:

• Mescolamento fenotipico: infezione di una cellula da parte di due virus differenti e montaggio di proteine strutturali da entrambi i virus
• Mescolamento genotipico: nucleocapsidi di due virus correlati, ma differenti per qualche carattere genetico, vengono inglobati in uno stesso pericapside
• Interferenza: presenza di un virus nella cellula impedisce la moltiplicazione di un altro virus che voglia replicarsi nella stessa cellula, tramite la produzione della proteina interferon
• Complementazione: interazione tra due virus difettivi o tra un virus difettivo e uno normale

Altri meccanismi di variabilità per cui si ha variazione degli antigeni di un virus, ovvero la parte proteica che è riconosciuta dal sistema immunitario:

• Deriva antigenica: variazione antigenica continua che si manifesta con piccole variazioni che il virus assume negli anni, senza che ci sia una modifica drastica. Esempio: i virus dell’influenza variano ogni anno le loro componenti proteiche
• Shift antigenico: fenomeno più massiccio, si ha un’ampia ricombinazione di segmenti genomici, con alterazioni molto estese. Ogni 5/10 anni si ha un cambiamento antigenico importante in seguito alla somma di tutte le piccole mutazioni, si ha variazione del riconoscimento antigenico del virus

Coltivazione dei virus

I virus non possono crescere in terreni artificiali poiché sono parassiti endocellulari obbligati e necessitano di cellule viventi per moltiplicarsi. Serve una coltura cellulare, costituita da cellule vitali che possono fare da substrato per la crescita del virus. Queste cellule possono derivare da:

• Animali da esperimento
• Uovo embrionato: il virus viene inserito nella camera amniotica o nel sacco vitellino, dove si mantiene e si coltiva
• Colture cellulari derivate da sospensioni di cellule ottenute da organi interi, sminuzzati tramite enzimi proteolitici o tramite agenti chelanti. Cellule fatte crescere in vitro, in un terreno di coltura, a formare uno strato cellulare

Si dividono i tipi di colture cellulari in:

• Colture primarie: le prime cellule ottenute dal tessuto di origine
• Colture secondarie: si originano dalla replicazione delle colture primarie per un certo numero di cicli
• Linee continue o trasformate: sono cellule che non si fermano