Virologia

DIAGNOSTICA VIROLOGICA

La diagnostica virologica è una disciplina che mette assieme la pratica alla microbiologia teorica.

Prima dell’avvenire della modernità nell’ambito delle tecniche scientifiche , la diagnostica si basava

solo sull’osservazione specialmente sui sintomi, ma questo risultava utile solo in casi in cui essi

fossero estremamente visibili e distintivi come nella rabbia o poliomielite. Nei casi di patologie con

sintomi molto simili ad altre patologie, l’osservazione clinica non era abbastanza. Intorno al 1950

iniziarono ad essere sviluppate tecniche molecolari molto fini per la rilevazione di specifici pattern

molecolari che assumessero la presenza di un virus

DIAGNOSTICA VIROLOGICA

●​ approccio diretto o virologico→ rilevazione dell’infezione attraverso agente infettivo in un

liquido corporeo

●​ approccio indiretto o immunologico→ rilevazione di pattern molecolari che

rappresentassero una risposta immunitaria all’agente, analisi pur sempre sierologica.

TECNICHE DI ANALISI DIRETTA

●​ Electron Microscopy→ tecnica analitica diretta che permette la visione del virus e del viral

yield. E’ stata scoperta da Ernest Ruska che vinse anche il premio Nobel 1986. Egli lo costruì

nel 1933. Anche se poi divise il premio con Gerd Binning per la progettazione dello scanning

tunneling microscope

●​ Optical Microscopy→ analisi istologica dei tessuti per individuare corpi di accumulo del

materiale virale visibili in cellule infette. Questa tecnica rende comunque difficile

l’avvistamento dei virus perché hanno dimensioni esigue cioè circa 10^-7 m

Queste due analisi permettono di individuare l’effetto citopatico di un virus sull’ospite

●​ Antigen Detection→ Rilevazione antigeni, presenza di antigeni virali nei campioni attraverso

metodi immunologici, IMMUNOFLUORESCENZE e IMMUNOPEROSSIDASI

●​ Nucleic Acid Detection→ rilevazione acidi nucleici con metodi come ibridazione e PCR.

Virus= “parassita endocellulare obbligato”, ma prima beijerinck usò l’espressione “fluido

contagioso vivo”

MICROSCOPIA ELETTRONICA

-​ SEM→ microscopio elettronico a scansione, per analizzare invece le superfici dei campioni,

fornendo immagini precise sulla superficie esterne dei campioni. Questo sfrutta elettroni

knocked-off per creare un’immagine

-​ TEM→ microscopio elettronico a trasmissione per osservare strutture interne come le

particelle virali, sfrutta elettroni trasmessi attraverso il campione per avere immagini ad alta

risoluzione delle particelle virali

in particolare la tecnica è stata migliorata con microscopia elettronica di tipo CRYO che ha portato al

premio nobel nel 2017

Si basa su una fissazione particella virale e una colorazione per renderla visibile.Richiede

congelamento perché si basa su azoto liquido che porta a congelamento. La CRYO-TEM permette di

raccogliere immagini dello stesso virione dette tomogrammi e permette di realizzare un'immagine

bidimensionale sia della superficie esterna che interna del virus. Quando queste non possono essere

coltivate in vitro ma per descriverne e osservarne le caratteristiche morfologiche .Ovviamente questo

non permetterà di avere informazioni sul genoma virale, su l'infettività o comportamento del virus.

Ad esempio è stato possibile visionare dei campioni di : Calicivirus, Rotavirus, Adenovirus,

Poliovirus

VANTAGGI:

●​ analisi di tutto ciò che è presente nel campione

●​ per descrivere virus ancora non riconosciuti o in stadi precoci

●​ non richiede reagenti specifici: ne rileva la presenza

SVANTAGGI

●​ costi elevati

●​ personale altamente specializzato

tecnica poco sensibile per avere immagini con alta risoluzione bisogna avere almeno 10^6

particelle per mL.

Da informazioni quindi sulla morfologia e struttura ma non sul genoma, su infettività o

funzioni biologiche

MICROSCOPIA OTTICA

Fa parte delle tecniche dirette o virologiche, con limitazioni significative.Si riescono a vedere dei

corpi nel campione ma non le particelle virali o virioni in maniera diretta. Si ha infatti una visione

indiretta di queste ultime perché si evidenzia soprattutto l’effetto citopatico(CPE) che ha uno

specifico virus sulle cellule ospiti. Un esempio può essere la formazione di sincizi. Questa però non è

una tecnica definitiva e conclusiva per discriminare la presenza del virus nel campione. Perciò in

Citomegalovirus→ Occhi di Gufo nei nuclei

Virus della rabbia→ Corpi di Negri nel citoplasma

Papillomavirus→ Coilociti→ comunque è necessario rilevare il dna virale per la genotipizzazione

del ceppo specifico

ANTIGEN DETECTION

Antigene: sostanza che può essere riconosciuta dal sistema immunitario

Immunogene: sostanza che può causare una risposta immunogenica da parte del Sistema immunitario

per produrre Anticorpi contro di esso

La tecnica è basata sul riconoscimento proprio di antigeni virali in un tessuto o cellule stesse. Legame

debole che può essere anche reversibile di solito composto da legami a idrogeno o interazioni

elettrostatiche. Interazione del tipo chiave e serratura dove l’anticorpo lega in modo specifico

l’antigene per formare un complesso antigene-anticorpo.

●​ anticorpi monoclonali→ progettati per riconoscere un singolo epitopo di un antigene,

dando specificità.

●​ antigeni policlonali→ epitopi differenti dello stesso antigene, sono meno specifici e

possono dare una risposta più ampia.

●​ affinità→ cruciale nella rilevazione di antigeni, forze attrattive o repulsive tra antigeni e

anticorpi. Più è alta e più determina una maggiore forza attrattiva tra un antigene e il suo

anticorpo

●​ avidità→ rappresenta la forza di legame multiplo tra anticorpo e antigene. Legame con alta

avidità identifica che ha più siti di legame tra antigene e anticorpo sono coinvolti

stabilizzando l’interazione, quindi un anticorpo interagisce maggiormente con antigene,

essendo più avido per quell’epitopo o determinante antigenico

●​ specificità→ si riferisce alla capacità di un anticorpo di legarsi ad un determinato antigene.

Una alta specificità è fondamentale per dare falsi positivi ossia riconosciemnto errato di un

antigene non target

●​ sensibilità→ quantità minima di antigeni che può essere rilevata da un anticorpo o test.

Sensibilità maggiore= prevenzione di falsi negativi, quando un antigene non presente è

rilevato. ELISA altamente sensibile immunofluorescence invece sono meno sensibili e dare

falsi positivi.

●​ Cross-reattività→ quando determinati anticorpi reagiscono con antigeni con cui condividono

falsi positivi, reazione che suggerisce la presenza di antigene,

epitopi comuni. Questo porta a

l’anticorpo sta reagendo con antigene diverso ma simile.

IMMUNOISTOCHIMICA

Utilizzate per diagnosi diretta. Si possono distinguere due analisi immunologiche

●​ Immunofluorescenza→ fluoroforo, molecola che emette luce fluorescente quando eccitata

●​ Immunoenzimatica→ si impiega un enzima per il rilevamento

1.​ IMMUNOENZIMATICA

Tecniche più diffuse: Immunoperossidasi→ si sfrutta il cambiamento di colore del substrato, indica

la positività per antigene di interesse. Tecnica usata nella pratica in associazione con tritatura virale

per individuare antigeni infettati in cellule infettate. Questo succede con particelle virali di

Coronavirus dove si produce un deposito di colore per la positività. Aspetto semiquantitativo per

andare selettivamente ad individuare cellule positive da quelle negative in un tessuto infetto in un

campione

2.​ IMMUNOFLUORESCENZA

Tecnica che sfrutta un fluoroforo al posto di un enzima

●​ Immunofluorescenza diretta→ lega direttamente anticorpo primario che lega l’epitopo

dell’antigene

●​ Immunofluorescenza indiretta→ anticorpo secondario, riconosce e si lega all’anticorpo

primario già legato all’antigene. Questa è pratica soprattutto all’individuazione dell’antigene e

all’amplificazione del segnale quando l’antigene è espresso in

quantità basse. Ad esempio nel HCMV(citomegalovirus) c’è un

espressione a cascata di antigeni virali.

1)​ Espressione di geni precoci nel nucleo delle cellule infettate (24h

post-infezione)

2)​ Espressione geni tardivi nel citoplasma (72h post-infezione)

Si può quindi valutare l’avanzamento dell’infezione.

In entrambi casi si tratta di tecniche semi qualitative e semiquantitative cioè

rilevano la presenza o assenza di antigene virale che legate alla

concentrazione antigene

Riconoscimento di antigeni con anticorpi primari:

●​ anticorpo per IE1/2

●​ Anticorpo per UL72

Separazione anticorpi primari grazie all’uso di anticorpi secondari.

Riconoscimento specie specifico, la regione costante (Fc) dell’anticorpo

primario per discriminare le due reazioni.

ALTRA APPLICAZIONE

Usata affiancata alla Citometria a flusso: cellule viaggiano in maniera

lineare e affilate in un capillare e sono illuminate da un laser man mano.

In base alla fluorescenza emessa da cellule marcate con anticorpi viene

rilevata da detettori con segnali positivi o negativi a seconda della

presenza dell’antigene

Grazie a questa tecnica si riesce a valutare la positività in maniera

corretta e specifica potendo ottenere una lettura multidimensionale

con un grafico a quattro quadranti dando discriminazione precisa degli

antigeni nelle cellule

Western Blot→ per indagare la presenza di proteine virali durante

l’infezione come nel HCV in cui si visualizzano proteine precoci o

tardive secrete dal virus a stadi differenti.

La procedura prevede la separazione delle proteine virali sulla base di

elettroforesi su gel seguita da trasferimento su membrana. Positività

viene rilevata da sostanza chemio-luminescente Segnale catturata su

lastra fotografica in una camera oscura. Rilevanza radioattiva, oggi

si preferisce l’uso di segnali chemio-luminescenti per sicurezza e

praticità. Prima veniva usata una sostanza radioattiva ma ora si usano

solo segnali luminescenti per sicurezza e praticità.

DETECTION OF NUCLEIC ACID

Tecnica molecolare alla base di questa pratica è la PCR (Polymerase Chain Reaction) scoperto e

sviluppato da Kary Mullis nel 1993. PCR da amplificazione del DNA che consente di raddoppiare la

quantità di materiale genetico all'inizio del processo. Il primer è una sequenza di DNA sintetico che si

lega in modo specifico ad un tratto della sequenza genetica del virus e non permette di ottenere

informazioni quantitative: indica solamente la sua presenza o assenza senza stabilire la quantità di

particelle virali presenti.

ESEMPIO

Essa è usata nella genotipizzazione del HPV se sia un’ infezione di tipo 16 o 18, in questo caso si

sequenzia sulle basi nucleotidiche dopo la PCR. Con questa procedura è possibile determinare il

ceppo specifico del virus

PCR nested→ variante della PCR che prevede due fasi di amplificazione

1.​ amplificazione di un frammento di DNA più grande,

2.​ amplificazione più piccola questo approccio aumenta notevolmente la sensibilità del test

PCR classica che non da informazioni sul ceppo virale. Permette di stabilire se il

come la

virus è presente o assente nel campione.

REAL TIME E DIGITAL PCR

1.​ Real Time PCR→ si basa sullo stesso principio

della pcr tradizionale con una differenza

fondamentale. Permette il monitoraggio in tempo

reale dell’amplificazione grazie a segnali

fluorescenti emessi durante la reazione. Da la

possibilità di valutare il CYCLE THRESHOLD.

Esso rappresenta il ciclo con cui è rappresentato il

valore di amplificazione

a.​ se il segnale di amplificazione appare

presto, vuol dire che nel campione vi è una

grande quantità di materiale genetico

virale

b.​ al contrario un ritardo del segnale indica una quantità minore di DNA o RNA virale

●​ Analisi relativa→ confronto di una condizione di controllo con un campione sottoposto a

trattamento senza ottenere un valore assoluto

●​ Analisi semi quantitativa→ fornisce un dato non precisissimo sulla quantità di materiale

genetico presente nel campione

Per una Quantificazione assoluta con Real time PCR si costruisce una curva standard sulla base di

un gene di riferimento clonato in un plasmide, di cui si conosce la concentrazione esatta e il

numero di copie.

2. Digital PCR→quantificazione assoluta C’è un passo avanti perché vi è la segregazione

del campione in piccole goccioline (micro droplets) circa 20.000, da ognuna delle quali è possibile

ottenere una valore assoluto della quantità di virus presente senza bisogno di una curva standard

facendo delle micro reazioni per ogni droplet

E’ molto versatile perché non necessita per forza plasmidi di riferimento ma serve per ottenere

comunque un preciso dato quantitativo

Tutto ciò permette di misurare la carica virale presente in un campione. NON sono però in grado di

determinare l’infettività delle particelle virali rilevate. I primi test diagnostici covid erano basati

proprio sul funzionamento della PCR molecolare che rileva anche a distanza di tempo ed è questo che

porta il paziente ad essere positivo anche per 30 giorni. Ma tale positività non significa che

necessariamente si è infettivi.

COLTIVAZIONE VIRALE

Questa è una tecnica usata in vari ambiti specialmente in scientifica e diagnostica. Si usano diversi

modelli siccome i virus devono crescere in una cellula ospite:

-​ Animali da laboratorio→ usati principalmente per ricerce sulla patogenesi virale e per

produrre vaccini anche se non sempre riflettono le caratteristiche umane. Si prefiligono perciò

modelli umanoidi

-​ Uova embrionate di pollo→ Produzione vaccini e ricerca patogenesi. Il limite è che questi

vaccini essendo prodotti sulla base di uova di pollo, non possono essere usate per la

somministrazione sugli allergici. Orthomyxovirus, inattivato è stato designato il suo vaccino

sulla base di ciò. Nel 1938 è stato introdotto da Goodpasture.

-​ Colture cellulari, le più usate→ Grande progresso nello studio dei virus. Poliovirus è stato il

primo studiato con questa tecnica. Nel 1954 grazie a Ender Weller e Robbins si vinse il Nobel

1.​ Colture primarie→ prelevate da un organismo e mantengono una risposta corretta

2.​ Colture continue e immortalizzate→ sono state modificate geneticamente, però

proprio per la riprogrammazione metabolica potrebbero comportare un cambiamento

nella risposta metabolica. Un esempio è stato visto su cellule infette da papilloma

virus

RICONOSCIMENTO DELLE CELLULE IN COLTURA

Le colture cellulari sono utili per la diagnostica diretta delle infezioni virali. Tramite la microscopia

ottica è possibile osservare l’effetto citopatico ovvero le alterazioni morfologiche che una cellula

subisce quando infettata da virus. Questi effetti variano a seconda del virus e possono includere la

formazione di sincizi (fusioni tra cellule adiacenti), corpi di inclusione (proteine mal assemblate), lisi

(rottura della cellula infetta).

LISI CELLULARE

●​ Poliovirus→ rapido effetto litico sulle cellule ospiti e

rilasciano i virioni nell’ambiente in modo da estendere

l’infezione

●​ Herpes Simplex Virus→ stesso effetto citopatico,

effetto litico affine

PLACCA VIRALE

●​ Citomegalovirus→ cellule infette che non subiscono lisi

ma si ingrossano e si arrotondano e formano questa

placca virale. Si può identificare il Titolo virale , ovvero

quantità di virus infettante nel campione, grazie a

immunoperossidasi.

SINCIZIO

●​ Virus del morbillo→ dopo infezione le cellule formano una

cellula singola multinucleata.Tipico di alcuni virus che

causano queste strutture anomale

●​ Virus Respiratorio Sinciziale (RSV)→

CORPI DI INCLUSIONE

Alcuni virus possono infettare le cellule circostanti direttamente

dando trasmissione virale a contatto cellula cellula, invece di

essere rilasciati nel fluido extracellulare vanno a costituire questi

aggregati proteici mal assemblati

-​ Corpo di Negri→ Virus della rabbia

-​ Corpo di Guarnieri→ Infezioni da Poxvirus

-​ Occhio di Gufo→ Citomegalovirus umano

Virologia quantitativa, un campo che permette di individuare quanto un virus sia infettivo. Per

valutare ciò si deve ricorrere ad analisi molecolari.

PLAQUE ASSAY

si basa sul principio semplice: misurazione della capacità infettiva di una singola particella. Questa ha

comportato la vittoria del premio Nobel. Viene valutato il titolo virale per ciò. La soluzione che

contiene il virus è testata su una coltura monostrato(monostrato di cellule cresciute su una superficie

solida. Dopo aver inoculato il virus, si aspetta che avvenga il ciclo replicativo completo. Se l’effetto

citopatico è la lisi allora è facile osservare dei buchi nel campione comportati proprio da questo. Il

numero di placche è osservato è citato nelle diverse zone del corpo

●​ titolo virale= numero di placche/ fattore di diluizione della soluzione testata. Così si

evidenzia quante placche ci sono per millilitro. Questo in totale rappresenta la capacità di un

virus di innescare una infezione produttiva

La PCR quantitativa rappresenta un conteggio del materiale genetico virale, mentre il Plaque assay

misura la capacità infettiva del virus di dare un’infezione produttiva.

●​ Per valutare virus non litici invece si utilizza di solito la immunoperossidasi che non causano

distruzione immediata delle cellule infette, infatti da sola