Tossicologia generale - parte 1

Tossicologia generale

Prof. Carmela Fimognari, lez. 1, 30/09

Introduzione

La tossicologia è una disciplina che si occupa degli effetti tossici e indesiderati di sostanze inizialmente solo chimiche sugli organismi viventi. Oggi si occupa anche degli effetti tossici di uno xenobiotico (sostanza chimica) e si occupa anche dello studio di sostanze provenienti da virus.

Nei primi anni 80 la tossicologia ha visto il suo ruolo riconosciuto in vari ambiti. Negli anni ha subito diverse modifiche nella definizione degli obiettivi di questa disciplina perché inizialmente lo studio della tossicologia era diretto a studiare gli effetti di un tossico sull’uomo. All’inizio ruotava solo intorno all’uomo, aveva criterio antropocentrico. Ora invece la tossicologia si occupa di studiare l’effetto di un tossico non solo sull’uomo ma anche su tutti gli organismi presenti nell’ambito di un ecosistema. È ovvio che nessuna specie può sopravvivere in un ecosistema malato e alterato.

La tossicologia in particolare sia che si occupi di stabilire gli effetti di un tossico sull’uomo o sull’ecosistema, è una scienza predittiva cioè il tossicologo deve agire a monte, deve prevedere la tossicità di uno xenobiotico prima che questo entri in contatto con l’uomo o con l’ecosistema. Il tossicologo deve studiare la molecola che sia farmaco o pesticida o additivo, ne studia il profilo tossicologico prima che venga messa in commercio.

In particolare la tossicologia studiando gli effetti tossici di una qualsiasi sostanza è la scienza che va a definire i limiti di sicurezza di uno xenobiotico, cioè permette di quantificare numericamente le concentrazioni di sostanza tossica nell’ambiente e permette di stabilire dei limiti numerici che consentano l’uso sicuro di uno xenobiotico. Tutti i pesticidi inducono effetti tossici così come farmaci ma noi li usiamo in funzione della tossicologia che cerca di identificare degli intervalli sicuri. La tossicologia deve definire le proprietà tossiche di uno xenobiotico quindi deve stabilire quello che in tossicologia significa stabilire il pericolo di uno xenobiotico. Viene stabilito il profilo tossicologico, il pericolo di uno xenobiotico.

Non esiste sostanza a certi livelli di dose di indurre effetti avversi. Es: acqua che è la molecola più utile per l’uomo se ne beviamo 10 litri al giorno è pericolosa per l’uomo. Ogni molecola ha delle caratteristiche di pericolosità intrinseche ma esiste un rischio per l’uomo connesso alla sostanza tossica solo se vi è esposizione alla sostanza tossica. Non definiamo solo il pericolo ma anche il rischio cioè sapere che probabilità abbiamo che quella molecola produca un effetto avverso sull’uomo o sull’ecosistema.

In tossicologia rischio e pericolo sono 2 concetti diversi. Il rischio è uguale al pericolo moltiplicato per l’esposizione! Quando conoscendo il pericolo e l’esposizione si calcola il rischio che essendo una probabilità che è in seguito all’esposizione di una certa sostanza, si possa manifestare un esito avverso. È una probabilità perché il rischio dipende anche dalle caratteristiche intrinseche dell’individuo esposto a quello xenobiotico. Quando si prendono dei farmaci, ci sono individui che presentano alcuni effetti collaterali e altri no. Quindi: esposizione ai metalli, alcune persone hanno problematiche importanti per la salute e altre no. Una volta definito il rischio, il tossicologo può stabilire quella che si chiama Safety, sicurezza.

La sicurezza rappresenta la certezza pratica che l’uso di una sostanza in specifiche condizioni di modalità di impiego e di quantità non provochi un danno. Significa definire quali siano le strategie che consentono un uso sicuro di quella sostanza. Es: quando manipoliamo dei solventi tossici in laboratorio, questi possono avere un alto livello di pericolosità ma se li usiamo sotto cappa aspirante e coi guanti, questo serve a ridurre la probabilità di un rischio per la nostra salute.

Il pericolo rappresenta una minaccia per l’uomo, ma se non ho esposizione non avrò rischio per l’uomo viceversa se c’è anche l’esposizione c’è anche il rischio. Stimare il rischio rispetto a uno xenobiotico è legato al concetto di probabilità. Io posso essere esposta o non esposta a quello xenobiotico o essere esposta a livelli così bassi che non c’è il rischio. Il rischio è legato a quel fenomeno che si chiama suscettibilità individuale: quando sono esposta ad uno xenobiotico, il nostro assetto genetico ci può rendere più o meno suscettibili a una certa reazione tossica e quindi a un certo livello di rischio. La stima del rischio è un concetto probabilistico.

Es: autobus ha una latenza nel momento in cui l’autista frena più lunga rispetto all’auto. Il rischio di essere investiti dall’autobus non è un valore assoluto ma è un evento probabilistico e dipende dal fatto che vivo in una grande città che in un paese. Dipende dal fatto che io abiti in una via più trafficata o meno trafficata. Il rischio è legato a una serie di probabilità che riguardano in parte l’esposizione, in parte alcune caratteristiche individuali del soggetto esposto.

Se noi non possiamo definire il rischio in maniera assoluta, non possiamo definire nemmeno il concetto di sicurezza in maniera assoluta. Non abbiamo sostanze sicure in senso assoluto, anche l’acqua a certi livelli di dose non è sicura. Abbiamo comunque delle strategie per usare le sostanze tossiche in maniera sicura. Anche la sicurezza viene definita in termini probabilistici, cioè il tossicologo ci dice che quella sostanza è sicura in determinate condizioni.

Come si stima il rischio?

È definito dal livello internazionale in maniera inequivocabile, l’EPA è l’agenzia che si occupa di stabilire i valori limite e quindi la sicurezza di xenobiotici a livello ambientale. Negli USA c’è la FDA che si occupa di stabilire i limiti per integratori, pesticidi ecc.

Gli step per definire il rischio dell’EPA sono identiche a quelle della FDA. In qualsiasi parte del mondo quindi è definito in 4 fasi:

1 - Identificazione del pericolo

Identificazione del pericolo (proprietà tossicologiche di quel xenobiotico): quali problemi di salute per l’uomo e per l’ambiente saranno determinati dallo xenobiotico? Per rispondere a questa domanda il tossicologo deve condurre studi per investigare il profilo tossicologico dello xenobiotico.

Come lo definisco il profilo tossicologico di un composto? Il modo più semplice è basarsi sulle relazioni struttura-attività. Predire quindi la tossicità dalla sua struttura, ma è insufficiente. Poi si ricorre (modo più corretto) alla conduzione di test a breve termine in vitro e in vivo sull’animale da esperimento ed è proprio da questi studi che si ricava il profilo tossicologico di un composto.

Al vertice di questi approcci ci sono gli studi epidemiologici (studi sull’uomo) cioè avere info sulle proprietà tossiche della molecola direttamente sull’uomo ma è raro avere queste info perché la tossicologia è una scienza predittiva. Quand’è che abbiamo dei dati epidemiologici? Li abbiamo in 2 casi: o per molecole che non si trovano nell’ambiente intenzionalmente ma si trovano nell’ambiente o negli alimenti perché sono dei contaminanti rilasciati non intenzionalmente da attività antropocentriche.

Es: diossine, non sono state sintetizzate per uno scopo preciso, sono prodotti intermedi di alcuni cicli produttivi e sono prodotti che derivano dalla combustione di materiale organico clorurato. Gli inceneritori rilasciano nell’ambiente diossine. In casi del genere i dati sul profilo tossicologico vengono ottenuti da evidenze sull’uomo. Sappiamo che sono immunologiche per l’uomo e tossiche a livello cutaneo per l’uomo. La stessa cosa per gli IPA che vengono rilasciati dalla combustione incompleta di composti organici (anche semplicemente cucinare la carne) e sono cancerogeni per l’uomo.

L’altra classe di sostanze per cui abbiamo dati sull’uomo sono quelle sostanze messe in commercio prima degli anni 80. Prima i prodotti che venivano prodotti non erano sottoposti al vaglio tossicologico oppure era un vaglio tossicologico molto blando. Oggi sappiamo il loro potenziale tossico sull’uomo. Per tutte le molecole sintetizzate oggi o prodotte intenzionalmente chiaramente noi andiamo a stabilire il profilo tossicologico o in sistemi in vivo (animale) o in vitro e da qui risalire a effetti tossici per l’uomo. Gli studi sull’uomo vengono fatti solo per i farmaci.

Studi in vivo e in vitro

Che studi si fanno in vivo e in vitro?

• Studi di tossicità acuta (effetti causati da alte dosi di una sostanza per brevi periodi di tempo)
• Tossicità cronica (si manifesta dopo ripetute esposizioni a dosi contenute della sostanza tossica ma per periodi di tempo più lunghi rispetto alla tossicità acuta).

Queste 2 tipologie di studi si fanno perché bisogna conoscere gli organi target della tossicità.

• Tossicità sul sistema riproduttivo: quando bisogna analizzare la tossicità sul sistema riproduttivo bisogna guardare se il tossico altera la capacità fertile maschile e femminile (composto reprotossico). Dobbiamo andare anche a capire e testare se la sostanza su un animale gravido indurrà effetti tossici sull’embrione o per il feto. Ci manca anche la tossicità post Natale, dobbiamo anche verificare cioè cosa succede se somministro questa molecola nel momento post natale perché alcuni organi e sistemi del prodotto del concepimento, continuano il loro sviluppo e processo di maturazione anche alcuni anni dopo la nascita.
• Mutagenesi (alterazioni del materiale genetico): l’alterazione del DNA è associata a patologie neurodegenerative, cancro, ecc.
• Cancerogenesi (capacità del composto di indurre tumori): i tumori sono caratterizzati da alto tasso di morbilità e mortalità e sono patologie di difficile trattamento.
• Tollerabilità locale: effetti tossici che si hanno quando la sostanza entra in contatto con cute e mucose (es. collirio).

Se entro in contatto con uno xenobiotico per via parenterale ho la situazione più pericolosa perché è caratterizzata da una biodisponibilità altissima. Invece se entro in contatto con lo xenobiotico con la cute, questi con difficoltà arriveranno a livello sistemico per via della cute che lascia entrare solo sostanze lipofile.

Se entro in contatto con lo xenobiotico a livello del tratto GI ho la situazione meno pericolosa perché ho il pH, enzimi proteolitici, anche nel tratto GI ci sono tutta una serie di macrofagi residenti e qualsiasi sostanza assunta per via os dall’intestino attraverso la via porta arriva al fegato che detossifica e metabolizza le sostanze tossiche. Andando dall’alto verso il basso aumentano le problematiche tossicologiche passando dal tratto GI a un’esposizione attraverso la cute o i polmoni.

Se entro in contatto con uno xenobiotico per via inalatoria, l’esposizione a livello dei polmoni non è così invalidante perché abbiamo l’ascensore mucociliare, vi sono gli enzimi del farmaco metabolismo, i macrofagi alveolari. Anche la via polmonare come la cute è molto protetta.

Ci sono composti che possono indurre reazioni allergiche, si manifestano nella loro totalità non alla prima esposizione al tossico ma alla seconda e possono andare da lievi (orticaria, prurito) fino a shock anafilattico.

2 - Definire il pericolo in termini quantitativi

Definire il pericolo in termini quantitativi (stabilire a quali dosi si verifichi l’effetto immunotossico, nefrotossico, epatotossico, ecc.): quali sono i problemi per la salute all’esposizione di diverse dosi del nostro composto in studio? È uno studio che viene fatto sia in vitro che in vivo.

In vitro tratterò le mie colture cellulari con dosi diverse per composti in studio, in vivo somministro all’animale da esperimento dosi diverse del composto in studio. Qualsiasi sostanza ha un certo intervallo di dosi in cui non è tossica e un intervallo in cui è tossica. Questi studi vengono fatti con l’obiettivo finale della stima del rischio per l’uomo. Metterò a confronto il pericolo determinato in senso qualitativo e quantitativo in relazione al livello di esposizione nell’uomo.

Quindi io so che il composto X è epatotossico a certi livelli di dose, andremo a prevedere quali saranno i livelli di esposizione per l’uomo e andremo a vedere se questi livelli di esposizione sono vicini o lontani ai livelli che risultano tossici in vivo o in vitro. Più i livelli espositivi previsti per l’uomo sono vicini ai livelli in vivo e in vitro, maggiore è il rischio associato a quella sostanza.

Come si procede per questa analisi quantitativa del pericolo? Si costruisce una curva dose-risposta in cui si va a documentare cosa succede all’aumentare della dose all’organismo animale o in una coltura. Andremo in questo modo a quantificare il pericolo. È una curva su cui sull’asse delle x abbiamo la dose e sull’asse delle y la risposta tossica misurata.

Normalmente la curva ha un andamento a sigmoide. Abbiamo dei livelli di dose in cui non c’è effetto tossico (risposta misurata è zero) poi a partire da un certo livello di dose, la risposta tossica aumenta all’aumentare della dose fino a raggiungere un plateau (efficacia tossica massima). Plateau significa che tutti i recettori del tossico sono occupati dallo xenobiotico e a quel punto anche se aumento la dose, l’effetto tossico rimane costante.

Quando costruisco una relazione dose-risposta significa che io per costruire la sigmoide devo essere certa che l’effetto tossico che osservo sia dovuto all’agente tossico che ho somministrato all’animale o con cui ho trattato le mie colture. Questo non è un fatto banale. Se io manipolo una coltura cellulare in maniera troppo aggressiva un certo numero di cellule muoiono, allora io in quel caso ho una morte cellulare non dovuta all’agente tossico ma a una manipolazione errata delle colture.

Se parliamo di studi in vivo, se io non so manipolare gli animali in maniera corretta, li spavento o parlo ad alta voce nel locale in cui stanno gli animali, sono tutti fattori di stress per l’animale che risponderà con una serie di alterazioni della sua fisiologia che io potrei confondere per alterazioni provocate dal composto in studio. Gli esperimenti tossici sia in vivo che in vitro devono essere portati avanti da personale specializzato.

La risposta osservata deve essere funzione della dose. Vuol dire che esiste un target molecolare o cellulare con cui lo xenobiotico agisce, interagisce e da cui discende l’effetto tossico. L’entità della risposta è in relazione alla concentrazione della sostanza nel sito di azione, se aumenta la quantità di sostanza che arriva nel sito di azione, aumenta la risposta tossica misurata. La concentrazione del tossico nel sito bersaglio è in relazione alla dose misurata fino al raggiungimento di un plateau.

Per costruire una curva dose risposta devo avere un metodo, un test attraverso cui misurare un effetto tossico. Se devo valutare un effetto cancerogeno, devo avere dei saggi, dei test con cui valutarlo. Quindi se devo costruire una curva dose-risposta devo essere sicura di:

• L’effetto che osservo è dovuto alla sostanza somministrata.
• La risposta osservata è in funzione della dose della sostanza somministrata.
• Devo avere un saggio, un metodo o in vitro o in vivo per misurare l’effetto tossico.

La curva dose-risposta nella maggior parte dei casi ha un andamento ad S. Ci sono sostanze che fino a un certo livello di dose (basso) non inducono alcun livello tossico, poi giunti a un certo livello di dose soglia (treshold) da quel punto in poi all’aumentare della dose somministrata aumenta l’effetto tossico fino a raggiungere un plateau. La dose soglia (treshold) separa la dose di effetto da quella di non effetto.

Questa curva tutto sommato è rassicurante perché ci dice che per quel determinato xenobiotico che ha quel tipo di curva dose risposta, noi abbiamo un certo intervallo di dosi in cui pure essendoci esposizione alla sostanza, non c’è effetto tossico. Il problema è che ci sono alcuni xenobiotici che hanno una curva dose risposta che ha un andamento non a sigmoide ma ha un andamento lineare cioè è una retta passante per l’origine e allora in un caso del genere, la curva non è rassicurante perché l’unica condizione in cui la risposta tossica è nulla è nel caso in cui la dose è 0 (= non ho esposizione).

Quali sono questi composti caratterizzati da un’assenza di una soglia? Sono i composti genotossici, tossici per il materiale genetico. Per i genotossici è sufficiente una singola dose unitaria di xenobiotico per indurre un effetto genotossico o mutageno. Per i composti genotossici, la stima del rischio per l’uomo è complessa perché non abbiamo delle dosi prevedibili.

Una volta stabilito il pericolo in termini qualitativi e quantitativi, devono conoscere l’esposizione.

3 - Stima dell’esposizione

Stima dell’esposizione (quante persone saranno esposte in un certo arco di tempo a quel tossico?): io devo identificare le popolazioni umane esposte a quel tossico, attraverso quale via l’umano sarà esposto a quel tossico e stimare l’entità del tossico. Essendo la tossicologia una scienza predittiva, io queste analisi le devo fare prima dell’immissione in commercio.