Tossicologia generale e del farmaco - parte 3

Tossicologia lezione 15/03/22

Oggi vediamo come possono essere rappresentati in una curva i dati che raccogliamo nei nostri studi, che possono essere sempre rappresentati nelle così dette curve dose-risposta. Le curve dose-risposta hanno tantissimi utilizzi sia per quanto riguarda gli studi tossicologici, quindi gli studi di tipo preclinico, sia per quanto riguarda gli studi clinici e anche gli studi epidemiologici, cioè sulla popolazione.

A seconda dell’utilizzo che dovremo fare dei dati che vogliamo mettere in evidenza ottenere da una curva dose-risposta, questa curva può essere rappresentata in modi diversi, che si chiamano: curva dose-risposta graduale e curva dose risposta di tipo quantale.

Il concetto di base è sempre lo stesso che abbiamo già visto e quindi che all’aumentare della dose di uno xenobiotico avremo un aumento graduale della risposta, quindi un aumento graduale dell’effetto. Ovviamente questo si basa su un concetto che conoscete benissimo e cioè che all’aumento della dose dello xenobiotico, aumenta anche il legame del nostro xenobiotico con il suo recettore bersaglio, il suo recettore biologico, e quindi avremo un aumento graduale della risposta.

Voi siete abituati a vedere la curva dose-risposta di forma iperbolica, l’avete studiata in farmacologia, ed è la curva riportata nel grafico a sinistra in cui le dosi di farmaco, di xenobiotico, sono riportate su scala lineare e all’aumentare della dose aumenta l’effetto che si osserva in un determinato sistema biologico, in un individuo, comunque l’effetto indotto appunto dallo xenobiotico. Avremo quindi una curva iperbolica che nella porzione superiore ovviamente raggiunge una sorta di plateau quando l’effetto massimo è stato raggiunto, cioè quando tutti i recettori sono stati occupati.

Curva dose-risposta in scala logaritmica

Ora negli studi tossicologici, ma anche negli studi clinici o negli studi sulla popolazione, gli studi epidemiologici, è molto utilizzata l’espressione della dose, anziché su scala lineare su scala logaritmica, quindi rappresentare la curva dose-risposta in modo semilogaritmico. Questo cosa ci permette di fare? Intanto vedete che la curva diventa una curva di forma sigmoide.

Qual è il vantaggio di esprimere la curva dose-risposta in questo modo? Il vantaggio ovviamente è che noi stiamo dilatando le dosi basse di farmaco e questo ci permette di osservare delle risposte anche alle dosi più basse di farmaco, cosa che invece si perde nella curva a sinistra esprimendo le dosi su scala lineare.

Quindi un primo vantaggio nel riportare la dose in scala logaritmica è che stiamo espandendo la prima porzione della curva, quindi possiamo andare a vedere quali sono gli effetti del nostro xenobiotico, del nostro farmaco, alle dosi più basse, mentre stiamo ovviamente comprimendo la porzione più alta della curva che è quella che ci interessa meno perché riguarda gli effetti indotti dalle dosi più alte di xenobiotico che sicuramente saranno meno interessanti per noi soprattutto se stiamo valutando la risposta a un farmaco per esempio.

Nella curva sigmoide potete osservare che ci sono tre porzioni della curva. Abbiamo una prima porzione in cui la curva è praticamente piatta, mentre una seconda porzione corrisponde a tutto quel range di dosi in cui abbiamo un aumento graduale della risposta ad ogni aumentare della dose, ad ogni incremento della nostra dose.

Quindi la prima porzione corrisponde alle dosi molto basse in cui la risposta al farmaco è minima e quindi la curva assume un andamento quasi piatto, poi avremo un impennare della curva che corrisponde ad un aumento graduale delle risposte col graduale aumento della dose, fino ad avere nuovamente il plateau che corrisponde a quel range di dosi in cui invece è già stato raggiunto l’effetto massimo e quindi un incremento della dose non corrisponderà a un aumento della risposta al farmaco.

Detto questo che è valido sempre per le curve dose-risposta, cioè si preferisce sempre, qualunque sia il tipo di curva dose-risposta che noi vogliamo ottenere, si preferisce sempre esprimere le dosi su scala logaritmica per questi motivi che vi ho detto.

Curva dose-risposta graduale e quantale

La curva dose risposta può essere rappresentata in due modi, può essere rappresentata come curva dose-risposta graduale oppure dose-risposta quantale; il concetto è che sono due modi di rappresentare esattamente gli stessi dati, ciò che cambia è il modo in cui noi li rappresentiamo nella curva dose-risposta, ma i dati di partenza sono sempre esattamente gli stessi quindi il modo di rappresentarli dipende da ciò che noi vogliamo ottenere, dalla risposta che vogliamo ottenere, dai parametri che vogliamo mettere in evidenza all’interno della nostra curva.

Curva dose-risposta graduale

Che cosa rappresenta la curva dose-risposta graduale? Rappresenta la risposta media di un gruppo di individui che vengono esposti a dosi crescenti di uno xenobiotico. Come viene rappresentata la dose-risposta graduale? Viene rappresentata come al solito da un grafico in cui l’effetto è rappresentato in ordinate e la dose, le dosi crescenti, sono riportate in ascisse.

Per ogni dose che noi valutiamo, quindi per ogni dose che viene somministrata, nel nostro grafico dose-risposta avremo un punto, quel punto rappresenta sempre una media di valori e in particolare rappresenta la media dei valori ottenuti da tutti gli individui che hanno ricevuto quella dose più o meno la deviazione standard.

Costruzione di una curva dose-risposta graduale

Vediamo come si fa, per esempio come si costruisce una curva dose risposta di tipo graduale, in questo caso in un esperimento di tossicologia preclinico ma ovviamente lo stesso concetto può essere applicato a tutti i tipi di studio che noi vogliamo effettuare, anche uno studio sull’uomo, sulla popolazione.

Allora come procediamo per eseguire un esperimento che ci consentirà alla fine, una volta che abbiamo raccolto tutti i dati, di costruire questa curva dose-risposta. Abbiamo detto che è necessario che diversi gruppi di individui ricevano dosi crescenti dello xenobiotico, quindi da un punto di vista pratico quando noi dobbiamo eseguire un esperimento che cosa facciamo?

Prendiamo un numero n di animali, in questo caso il ratto per esempio, e lo suddividiamo nei diversi gruppi sperimentali in cui per gruppo sperimentale si intende quel gruppo di animali che riceverà una specifica dose; in questo caso per esempio nel nostro esperimento abbiamo programmato di somministrare 5 dosi di xenobiotico, cosa faremo?

Prenderemo un gruppo di per esempio 30 animali, li suddividiamo in gruppi sperimentali di 5 animali ciascuno e ad ogni gruppo sperimentale daremo una dose di farmaco, ovviamente i gruppi sono 6 perché ad un gruppo sperimentale dovremo dare il placebo, il veicolo, quando si fanno studi preclinici si parla di veicolo.

Quindi avremo un gruppo che riceve il veicolo, per cui il veicolo in cui è stato disciolto il nostro farmaco che sarà composto da una n per esempio di 5 animali; poi avremo un gruppo che riceve la prima dose quindi per esempio in questo caso la dose di 1 mg per kilogrammo, anche in questo caso sono 5 animali, non un animale mi raccomando perché ogni gruppo ha un n che deve essere almeno superiore a 3, quindi questa è la dose di 1; un altro gruppo di 5 animali riceverà la dose di 5 mg per kilogrammo, un altro gruppo la dose di 10, un altro di 50 e un altro di 100.

Mi raccomando ricordatevi che è sbagliato dare allo stesso gruppo di animali dosi crescenti, questa è una cosa che non so perché ma vi genera sempre confusione all’esame, voi dovete ricordare che ogni gruppo riceve una dose, se noi programmassimo l’esperimento in cui uno stesso gruppo di animali riceve un giorno la dose di 1, il giorno dopo di 5 e il giorno dopo di 10 staremo facendo una somministrazione ripetuta, sarebbe un protocollo totalmente diverso, che non ci servirebbe per costruire una curva dose risposta.

Quindi ciascun gruppo sperimentale deve essere costituito almeno da animali dragnaidi, cioè che non hanno mai ricevuto un trattamento prima, devono partire tutti dallo stesso livello, l’unica differenza è la dose incrementale di farmaco.

Supponiamo che in questo protocollo sperimentale noi vogliamo misurare la variazione della pressione arteriosa a seguito della somministrazione di dosi crescenti di quel farmaco, quindi ci organizziamo gli animali per gruppi sperimentali, somministriamo le dosi crescenti dopodiché in ogni gruppo sperimentale, quindi in ogni animale di ogni gruppo sperimentale andremo in questo caso a misurare la variazione della pressione arteriosa prima e dopo il trattamento.

Variabilità interindividuale e deviazione standard

Otterremo quindi un valore per ciascun animale, ovviamente sono valori abbastanza eterogenei, non è pensabile di ottenere lo stesso valore neanche all’interno di ciascun gruppo sperimentale, cioè neanche per ciascuna singola dose, perché ovviamente esisterà sempre una certa variabilità interindividuale, e questo lo potete vedere ad esempio nel veicolo quindi in assenza di farmaco, quindi prima e dopo la somministrazione del veicolo avremo una variazione della pressione che varia da animale ad animale e varia anche di parecchio.

Quando somministriamo la dose più bassa di farmaco anche qui avremo delle risposte che sono variabili, diverse da animale ad animale all’interno del nostro gruppo e così via col crescere della dose. Cosa faremo di tutti questi dati?

Per ciascun gruppo sperimentale noi ci misureremo la media dell’effetto ottenuto, quindi per esempio nel veicolo la media dei valori è 1,5 più o meno la deviazione standard che adesso non vi sto a spiegare come si misura, comunque è una formula matematica ovviamente che in questo caso è ±5,9; che cosa ci sta dicendo la deviazione standard?

La deviazione standard è un indice della dispersione dei valori rispetto alla media quindi più è grande la deviazione standard, maggiore è la dispersione rispetto al valore medio, quindi la distanza dei soggetti che fanno parte di quella popolazione rispetto al valore medio; quindi è un indice molto importante negli studi di tossicologia perché ci dà un’indicazione immediata della variabilità all’interno di un gruppo sperimentale.

Quello che potete notare è che nel veicolo la deviazione standard è altissima perché risente della variabilità interindividuale che si ha anche fisiologicamente all’interno di un gruppo, quindi senza la somministrazione di nessuno xenobiotico.

Una variabilità molto alta la ritrovate anche nelle dosi molto basse di farmaco, infatti alla dose di 1 mg per kilogrammo, la media è di 3,8 ma la deviazione standard, è addirittura ancora più alta della media, è di ±4,7 ciò vuol dire che la variazione di pressione che noi abbiamo trovato aveva una media di 3,8 ma vi sono animali che hanno un valore più alto di 4,7 e un valore più basso di 4,7 quindi una variabilità ancora molto molto ampia all’interno della popolazione e questo da tutto ciò che abbiamo detto le volte scorse capite anche perché.

Perché stiamo somministrando una dose molto bassa di farmaco che non avrà un effetto in tutti gli individui della popolazione, ma avrà un effetto soltanto negli individui diciamo più sensibili, più suscettibili all’effetto del farmaco, ecco perché per dosi così basse la variabilità è così elevata.

Infatti all’aumentare della dose vedete che la deviazione standard rispetto alla media si riduce molto, per esempio nella dose di 5 mg per kilogrammo la media è di 15,5 ±5,7 quindi vedete che rispetto alla media la deviazione standard si sta riducendo perché stiamo entrando in quel range di dosi che invece inducono una risposta nella maggior parte della popolazione e con l’aumentare delle dosi questa risposta diventa sempre più omogenea.

Vedete aumentiamo ancora la dose e la media sarà 18 ±6, aumentando ancora 27,2 ±9.

Cosa facciamo adesso di tutti questi valori? Quindi abbiamo ottenuto per ogni gruppo sperimentale un valore medio più o meno la deviazione standard. Ciascuno di questi valori rappresenterà un punto del nostro grafico che potrà essere espresso con la dose in scala lineare e con la dose in scala logaritmica; in ogni caso ogni punto del grafico rappresenta la media del valore ottenuto per quella dose e quindi per quel gruppo sperimentale più in questo caso solo la deviazione standard, la deviazione standard può essere solo in positivo oppure in positivo o in negativo dipende da come viene rappresentato il grafico, ma il concetto è sempre lo stesso.

Esempio: clorpirifos

Questo grafico che trovate nel casaret mi sembra nel primo o nel secondo capitolo del cabaret, ed è il grafico che viene riportato come esempio appunto di una curva dose risposta graduale e quindi ve l’ho riportato solo per vederlo insieme.

In questo caso abbiamo costruito una curva sulla risposta a un pesticida che è il clorpirifos ed è un insetticida organo-fosforico e quindi come tutti questi insetticidi il suo meccanismo d’azione consiste nell’inibizione di un enzima e precisamente nell’inibizione dell’acetilcolina-esterasi, in questo caso per esempio vengono messi a paragone la capacità del clorpirifos nel sistema nervoso centrale di inibire due tipi di colinesterasi: l’acetilcolinesterasi e la carbossilesterasi.

Si è proceduto così come vi ho spiegato nell’esperimento della pressione arteriosa, quindi stesso tipo di disegno sperimentale, per ogni gruppo sperimentale si è ottenuto un valore che è stato riportato in grafico per cui ad ogni punto corrisponde la percentuale di inibizione dell’enzima che si ottiene per ogni dose che noi abbiamo somministrato.

Ovviamente da questo grafico si capisce che il clorpirifos sarà più efficace ad inibire la colinesterasi rispetto alla carbossilesterasi, perché alla stessa dose la percentuale di inibizione della colinesterasi è superiore rispetto alla percentuale di inibizione dell’altro.

Sotto vedete riportato lo stesso grafico così li mettiamo a confronto con la dose in scala logaritmica.

Efficacia e potenza dei farmaci

Ovviamente la prima applicazione che già conoscete di una curva dose risposta graduale qual è? È la valutazione dell’efficacia o della potenza per esempio di un farmaco, in cui vi ricordate che l’efficacia o efficacia ma la capacità di un farmaco di indurre una risposta massimale, quindi è indicata dall’altezza della curva e in questo caso per esempio valutando la curva dose risposta di due farmaci che sono la mepiridina e la pentazocina, sono due farmaci antidolorifici, quindi avremo la dose in scala logaritmica e l’effetto che sarà l’effetto antidolorifico di questi farmaci.

Come viene espresso questo effetto? Viene espresso come percentuale di inibizione del dolore. Quindi avremo una risposta di tipo graduale, con l’aumentare della dose nel nostro farmaco la riduzione del dolore aumenta gradualmente.

Stiamo parlando di riduzione del dolore su un organismo, cioè non stiamo parlando in questo caso di individui che mostrano una riduzione del dolore, cioè non stiamo facendo un’analisi di una popolazione, vi ricordate quando abbiamo visto la dose letale 50 abbiamo detto percentuale di individui che vanno incontro alla morte per una determinata dose? No in questo caso non stiamo parlando di quell’effetto, stiamo parlando dell’effetto che si osserva su ogni singolo individuo e che deriva dalla media dei valori di tutti gli individui, quindi la gradualità dell’effetto all’aumentare della dose.

Ovviamente da questo grafico, paragonando le due curve dose risposta, si capisce subito che la mepiridina avrà un’efficacia maggiore della pentazocina perché la curva delle mepiridina è più alta rispetto a quella della pentazocina.

Allo stesso modo la curva dose risposta può essere utilizzata per paragonare la potenza di due farmaci, la potenza invece vi ricordate che è un indice, ci indica la dose di farmaco necessaria per ottenere un effetto prestabilito, anche in questo caso abbiamo due farmaci antidolorifici, abbiamo un oppiaceo la morfina, e la mepiridina, la curva della mepiridina è spostata a destra rispetto alla curva della morfina e questo ovviamente ci indica che la morfina è più potente della mepiridina, cioè che saranno necessarie dosi più basse di morfina per ottenere lo stesso effetto, anzi partiamo dall’effetto → per ottenere un determinato effetto antidolorifico saranno necessarie dosi più basse di morfina rispetto alla mepiridina.

Questi son concetti che avete visto benissimo in farmacologia.

Ovviamente il confronto fra le curve ci permette di ottenere molte informazioni importanti quando si deve anche stabilire il regime terapeutico con un farmaco, cioè per esempio quando noi dobbiamo decidere che farmaco antidolorifico utilizzare per un determinato paziente, in una determinata terapia, potremo paragonare le curve dei due farmaci per verificare quale sia il farmaco più adatto.

Infatti che cosa si può verificare, questo l’abbiamo già visto, farmaco A verso farmaco B in questo caso abbiamo due farmaci che hanno la stessa efficacia ma potenza diversa; nel secondo grafico sempre farmaco A e farmaco B abbiamo due farmaci che hanno sia diversa efficacia sia diversa potenza.

Nel terzo grafico abbiamo farmaci che hanno diversa efficacia, ma a seconda della porzione della curva che noi andiamo ad analizzare potranno avere potenza uguale o diversa, per esempio nelle dosi più basse la potenza dei d