Tossicologia generale e del farmaco - parte 2

Somministrazione orale

Un’altra via molto utilizzata invece è la somministrazione orale, somministrazione orale che tra l’altro può avere anche il vantaggio di mimare l’assunzione di determinati farmaci da parte dell’uomo.

Per la somministrazione orale fondamentalmente esistono due modalità: una modalità è quella di inserire il farmaco direttamente all’interno di un pellet di cibo molto appetibile per l’animale, quindi si creano delle polpette all’interno del quale viene messo il farmaco e quindi l’animale deve assumere il farmaco attraverso il cibo.

Un limite di questa procedura è che gli animali in questo caso devono essere necessariamente stabulati singolarmente nelle gabbie perché altrimenti noi non riusciamo a capire la quantità di farmaco che ciascun animale ha assunto, che sappiamo essere fondamentale, per capire poi l’effetto tossico di quel farmaco, l’effetto terapeutico di quel farmaco.

Quindi in questi casi gli animali devono essere stabulati singolarmente e questo è uno svantaggio di questo tipo di somministrazione perché i roditori sono animali altamente sociali quindi stabulari singolarmente, isolarli dal contesto sociale è una profondissima fonte di stress per l’animale e se noi dobbiamo studiare farmaci per esempio che devono avere un effetto su patologie come l’ansia, la depressione anche le funzioni cognitive ovviamente i test che noi utilizziamo saranno alterati o influenzati dal tipo di stabulazione che abbiamo seguito.

Quindi non è consigliabile questo tipo di somministrazione per questi scopi.

Un altro tipo invece di somministrazione che attualmente è molto utilizzato sempre per via orale si chiama la somministrazione per gavage. Il gavage è un tubicino di materiale plastico, di polipropilene attualmente flessibile per cui poco invasivo e poco fastidioso per l’animale se si sa utilizzare, che viene collegato alla siringa e viene infilato direttamente nella bocca fino all’esofago dell’animale e attraverso questa somministrazione viene dato il farmaco.

Questo ci permette di effettuare le somministrazioni croniche giornaliere senza necessità di isolare gli animali ed evitando anche le somministrazioni parenterali che appunto possono avere degli effetti locali negativi.

Somministrazione intraperitoneale

Un’altra somministrazione molto utilizzata è la somministrazione cosiddetta intraperitoneale.

In questo caso vedete l’iniezione è effettuata nella parte bassa dell’addome, nel quadrante destro o sinistro dell’addome e questo tipo di somministrazione è molto importante da un lato perché è un modello di somministrazione orale, cioè il farmaco segue lo stesso percorso della somministrazione orale.

Se noi vogliamo testare l’effetto di un farmaco che dall’uomo verrà utilizzato prevalentemente per via orale e quindi che potrà andare incontro a metabolismo epatico, la via intraperitoneale è molto utile perché ci permette da un lato di somministrare quantità precise, molto più precise di farmaco rispetto per esempio alla somministrazione attraverso il cibo perché somministriamo direttamente noi, le monitoriamo attentamente, dall’altro il farmaco seguirà la tossicocinetica o la farmacocinetica che poi verrà seguita anche quando somministrato nell’uomo.

Poi è una via di somministrazione, visto chiaramente l’ampiezza dell’area in cui viene somministrato il farmaco, che ci permette anche di somministrare dosi elevate di farmaco quindi di nuovo soprattutto per farmaci poco solubili che richiedono elevati volumi per essere solubilizzati, questa via è molto consigliabile.

Somministrazione inalatoria

Ancora abbiamo la somministrazione per via inalatoria, anche questa è una somministrazione molto importante.

Questo è uno strumento abbastanza casalingo, ma esistono anche degli strumenti che sono venduti proprio dalle aziende che costruiscono questi strumenti, questo non è altro che un aerosol a uso umano adattato per la somministrazione inalatoria dell’animale, l’animale nuovamente viene messo per un tempo che generalmente va dai 5 ai 10 minuti, un quarto d’ora non di più e il muso è collegato proprio all’erogatore dell’aerosol in cui è stato messo il farmaco.

Altro sistema meno controllabile per la somministrazione inalatoria sono delle camere che adesso abbiamo anche qui, sono state acquistate dagli stabulari dell’ateneo, sono delle grosse camere, delle scatole chiuse in cui viene insufflato lo xenobiotico a cui deve essere esposto l’animale e quindi poi l’animale viene esposto attraverso l’aria nella camera.

Questa via di somministrazione è molto interessante ovviamente per studiare sostanze volatili quindi per esempio l’effetto dei solventi, ed è molto interessante non solo per studiare l’effetto di sostanze che devono avere un assorbimento polmonare ma anche perché si tratta di un mezzo che permette un accesso rapido dei farmaci al sistema nervoso centrale.

Adesso è un sistema molto utilizzato per studiare nuove formulazioni di farmaci, che magari tipicamente possono essere assunti per via orale, attraverso le quali invece il farmaco può essere assunto per via inalatoria e attraverso il nervo olfattivo va direttamente al sistema nervoso centrale.

Vi faccio un esempio: nella malattia di Parkinson i farmaci più utilizzati sono, forse l’avete già studiata, la L-DOPA oppure la morfina, tutti farmaci che vengono assunti di solito per via orale, sotto forma di compresse.

Cosa succede, nella malattia di Parkinson col passare degli anni col progredire della malattia e con la terapia soprattutto di L-DOPA, influenza notevolmente purtroppo l’andamento della sintomatologia, l’individuo va incontro a dei periodi di malattia che vengono chiamati on o off, cioè periodi in cui è sotto l’effetto del farmaco, che sono i periodi di on in cui l’individuo il paziente riesce a muoversi, a camminare quindi a completare le azioni diciamo motorie, alternati a periodi improvvisi di off in cui l’individuo praticamente va incontro al freezing, cioè non riesce più a muoversi, non riesce più a camminare e questo è dovuto largamente anche proprio ad un effetto della terapia con L-DOPA.

Si stanno studiando, ed esistono attualmente anche già sul mercato dei sistemi che servono come sistemi emergenziali in queste fasi, perché voi potete immaginare un paziente che ha bisogno di uscire di casa, di fare commissione e se si trova sempre in una situazione di off quando si trova fuori casa è veramente una situazione difficoltosa.

Esistono questi sistemi che sono degli spray per esempio di apomorfina che vengono inalati un po’ come si fa con gli antistaminici e che permettono all’individuo di non andare in fase off, quindi sono dei sistemi emergenziali molto utili che hanno un effetto immediato perché il farmaco in questo caso arriva direttamente al cervello.

Questo è un sistema estremamente interessante e molto studiato proprio per nuovi tipi di somministrazione dei farmaci.

Un altro esempio, farmaci che se somministrati per via sistemica magari devono essere somministrati a dosi piuttosto elevate che potrebbero comportare anche degli effetti collaterali tossici, con questo tipo di somministrazione invece vincolandoli direttamente al sistema nervoso centrale è possibile abbassare la dose di somministrazione quindi ridurre gli effetti collaterali a carico di altri organi, di altri sistemi.

Somministrazione intracerebroventricolare

Fino adesso abbiamo parlato delle somministrazioni comunque di tipo sistemico, soprattutto nell’ambito delle neuroscienze, quindi di farmaci che agiscono sul sistema nervoso centrale, può essere utile soprattutto in fase di sperimentazione somministrare il farmaco direttamente in sede locale, quindi direttamente nel cervello perché questo ci consente di somministrare, di infondere quel farmaco in specifiche aree cerebrali e quindi ci permetterà da un lato di capire l’effetto del farmaco su un determinato circuito cerebrale, su determinati nuclei del cervello e dall’altro chiaramente un sistema molto utilizzato per studiare le funzionalità del cervello, delle varie aree cerebrali in questo caso si parla di somministrazione stereotassica.

È una modalità che prevede l’utilizzo di questo apparecchio che si chiama stereotassico nel quale vedete è presente una torretta, alla quale è collegato un infusore, un ago, a sua volta collegato ad una pompa da infusione.

L’animale viene montato attraverso queste barre nello stereotassico, le barre vengono inserite nelle orecchie dell’animale in modo da immobilizzare il cranio, il muso viene immobilizzato da questa parte che serve per immobilizzare la parte anteriore del cranio, dopodiché si effettua un’incisione della cute, ovviamente l’animale viene profondamente anestetizzato.

Attraverso l’ausilio di un atlante, che ci fornisce esattamente le coordinate nelle quali dobbiamo somministrare il farmaco, prendendo come punto di riferimento il bregma, quindi partendo dal bregma l’atlante ci dirà quanto dobbiamo spostarci a destra o a sinistra, avanti o dietro, faremo un piccolo foro con un apposito trapano e attraverso questo foro poi scenderemo secondo una precisa coordinata anche in profondità sull’asse Z per somministrare il farmaco in una precisa area cerebrale.

Questa è un’altra metodica utilizzatissima nelle neuroscienze, per esempio noi lo utilizziamo per somministrare delle tossine in generale, che inducono proprio la malattia di Parkinson, nel nostro gruppo di ricerca studiamo la malattia di Parkinson e quindi per ottenere un modello neuropatologico di malattia di Parkinson somministriamo queste tossine in aree cerebrali specifiche nella sostanza nera che è l’area che va incontro a degenerazione nella malattia di Parkinson e induciamo appunto la malattia.

È una metodologia molto usata per lo sviluppo dei modelli animali di patologie.

Somministrazione cronica continua

Infine può rendersi necessario somministrare il farmaco in maniera cronica ma continua quindi non somministrazioni ripetute croniche, ma ripetute con un intervallo tra una somministrazione e l’altra, ma somministrazione continua che è una somministrazione che serve per mimare per esempio ciò che nell’uomo viene effettuato per esempio con la PEG oppure con i cerotti transdermici che quindi rilasciano lentamente il farmaco e così via.

In questo caso nel roditore possono essere utilizzate delle pompe osmotiche, ne esistono che vengono impiantate sottocute sul dorso del roditore con un intervento molto molto semplice, ovviamente ne esistono diverse dimensioni a seconda che debbano essere impiantate nel ratto o nel topo.

All’interno delle pompe osmotiche è presente questo tubicino in cui viene caricato il farmaco. La parte esterna, l’involucro è una membrana semipermeabile e all’interno è presente uno strato che ha un’elevata osmolarità.

Quando la pompa osmotica viene impiantata la permeabilità della membrana permetterà il passaggio dei liquidi all’interno della pompa osmotica, l’elevata osmolarità dello strato intermedio faciliterà il passaggio dell’acqua, l’assorbimento dell’acqua man mano che la pompetta osmotica si riempie di liquido andrà a comprimere il reservoir e questo provocherà la fuoriuscita del farmaco dall’estremità della nostra pompetta osmotica con un flusso che viene stabilito attraverso questo moderatore che ci permette di stabilire la velocità di uscita del farmaco.

Quindi è una somministrazione cronica che permette un rilascio molto preciso e controllato del farmaco.

Vie di esposizione a livello preclinico

Queste erano le vie di esposizione a livello preclinico.

Quindi abbiamo detto il primo parametro riguardante l’esposizione, che influisce sulla tossicità di uno xenobiotico è la via di esposizione, secondo parametro la durata dell’esposizione.

Ovviamente per molti xenobiotici, il tipo di esposizione, cioè che si tratti di esposizione acuta per cui un’unica esposizione singola o esposizione cronica o ripetuta o comunque prolungata nel tempo potrà profondamente determinare il tipo di tossicità.

Per questo motivo anche nei test di tossicità preclinici sono richiesti degli esperimenti, dei test che ci diano informazioni su tutti questi tipi di tossicità quindi vengono effettuati prima di tutto i test di tossicità acuta e poi i test di tossicità ripetuta i quali a loro volta si suddividono in test di tossicità subacuta, subcronica e cronica, questo lo rivedremo in maniera molto più approfondita quando faremo i test di tossicità.

Si parla di esposizione acuta agli xenobiotici quando l’esposizione avviene entro le 24 ore, si parla di esposizione subacuta quando si verificano esposizioni ripetute fino a un mese, esposizione subcronica invece l’animale viene esposto allo xenobiotico per una durata da 1 a 3 mesi e l’esposizione cronica sono esposizioni ripetute per più di tre mesi.

Quando parliamo di esposizione acuta, quindi ad una singola esposizione o comunque un’applicazione nell’arco delle 24 ore, vuol dire che noi possiamo esporre l’animale o ad un’unica somministrazione di xenobiotici o anche a più somministrazioni dello xenobiotico, ma sempre nell’arco delle 24 ore.

L’esposizione ovviamente potrà venire per tutte le vie di somministrazione che abbiamo visto compresa la via inalatoria e in questo caso avremo appunto un’esposizione come vi ho fatto vedere prima, l’esposizione inalatoria continua comunque per un periodo al di sotto delle 24 ore.

Come vi ho detto prima l’esposizione ripetuta cioè subacuta, subcronica e cronica, è molto utilizzata la somministrazione orale soprattutto attualmente la somministrazione per gavage e ovviamente quando parliamo di somministrazione cronica che appunto deve essere effettuata per un tempo superiore a tre mesi, la lunghezza del protocollo di somministrazione non è regolamentata in maniera rigida perché dipende dal tipo di xenobiotico che stiamo somministrando quindi dall’effetto che ci aspettiamo e soprattutto dall’utilizzo che questo xenobiotico avrà poi nell’uomo.

Ricordiamoci che i test di tossicità noi li facciamo perché ci servono per stabilire il rischio di tossicità di uno xenobiotico e quindi prevedere la potenziale tossicità e ovviamente l’effetto terapeutico sull’uomo.

Quindi nel test di tossicità cronica, la durata dell’esposizione cronica dipenderà appunto dal tipo di xenobiotico, quando per esempio si testano dei cancerogeni o per quanto riguarda xenobiotici tossici oppure per i farmaci che dovranno essere utilizzati in un regime di terapia cronica, nell’uomo la somministrazione di questi xenobiotici potrà durare anche per tutta la vita dell’animale, potrà durare, un ratto vive al massimo tre anni, per esempio per due anni la somministrazione, dipende dal tipo di xenobiotico.

Frequenza dell’esposizione

Infine il terzo parametro sempre relativo all’esposizione, quindi da questa prima fase della tossicità degli xenobiotici, il terzo parametro importante è la frequenza dell’esposizione.

L’effetto tossico dello xenobiotico quando viene somministrato ripetutamente può dipendere strettamente a volte anche totalmente proprio dalla frequenza della esposizione, cioè il fatto che si manifesti oppure no un effetto tossico dipenderà dall’intervallo che intercorre da un’assunzione all’altra, tra una somministrazione e un’altra.

Questo è spiegato molto bene in questo grafico che trovate nel Casarett, che ci fa capire come per molti agenti xenobiotici, gli effetti tossici di una singola dose possono essere molto diversi dagli effetti indotti da quella stessa dose ma frammentata in diverse somministrazioni e questo è strettamente dipendente dalla frequenza di somministrazione.

In questo grafico viene considerato l’effetto di 3 xenobiotici diversi A, B e C e viene messa in relazione la concentrazione nel sito bersaglio, quindi nel sito target di tossicità nell’organismo e la frequenza di somministrazione dello xenobiotico.

I quadrati celesti rappresentano il range di concentrazioni nel sito bersaglio per le quali lo xenobiotico inizia a indurre un effetto tossico, quindi concentrazione necessaria per ottenere una risposta tossica.

Vediamo cosa succede, i tre farmaci si comportano in maniera completamente diversa: a sinistra vedete l’effetto di una singola somministrazione mentre a destra vedete l’effetto di dosaggi ripetuti, di somministrazioni ripetute di quella stessa dose ma frazionata nelle varie somministrazioni.

Cominciamo dal farmaco A, questo se viene somministrato ad una concentrazione X, raggiungerà la dose tossica sulla sinistra del nostro diagramma, la dose tossica nel sito bersaglio e quindi indurrà un effetto tossico.

Se questa stessa dose di farmaco noi la frazioniamo e la somministriamo a questa precisa frequenza indicata in questo grafico, succede che a seguito della prima somministrazione nel sito bersaglio non viene raggiunto l’effetto tossico, quando noi somministriamo a distanza per esempio di un’ora supponiamo che queste siano somministrazioni intervallate di un’ora, somministriamo una seconda dose del farmaco ci troviamo in una condizione in cui la prima dose di farmaco non è stata completamente eliminata dall’organismo, quindi è ancora presente una certa concentrazione di farmaco nel sito bersaglio alla quale andrà a sommare