Ripasso prima parte del programma di Chimica e metodologie computazionali farmaceutiche

Banche dati

Tipi di banche dati

Primarie: contengono le info grezze, accompagnate giusto dalle info indispensabili. Es. GenBank, EMBL, DDBJ.

Secondarie: contengono analisi ed elaborazioni basate sulle info delle banche primarie. Es. UniProt, che comprende SwissProt e TrEMBL.

Integrate: permettono di passare facilmente dalle primarie alle secondarie (le unisce).

Database relazionali

Gestiti dai DBMS (Database Management System): i database visti in informatica, ovvero quelli in cui una colonna costituisce un campo, una variabile, e le righe i valori assunti annotati. Permette di fare ricerche attraverso l’invio di query (richieste) utilizzando linguaggi appositi quali SQL. Le informazioni sono quindi strutturate in tabelle. In generale comunque, le stesse info possono essere mostrate in modo sequenziale con testo non formattato ma comunque ordinato come nel flat file, in modo tabellare come nei database relazionali o in forma sequenziale con un’interfaccia grafica di più facile consultazione per gli umani.

Flat File: è il tipo di file utilizzato da queste banche dati per riportare le informazioni relative ad una determinata cosa (es. sequenza genetica di un determinato microrganismo). Si tratta di un file in cui le info sono organizzate in elenchi. Questa organizzazione permette di valutare ed estrarre velocemente con dei programmi appositi le info riportate in ogni flat file.

NCBI

NCBI: National Center for Biotechnology Information. È la più importante organizzazione bioinformatica statunitense, la quale collega tra loro diversi database in modo da garantire l’accesso al maggior numero di info possibili. Ospita GenBank e ha strumenti di analisi come BLAST. Permette quindi di accedere a sequenze nucleotidiche, proteiche, mappaggio di cromosomi e genomi, struttura 3D e dati bibliografici come quelli di PubMed.

• GenBank: contiene i geni delle specie caratterizzate, le interazioni tra geni e info bibliografiche.
• Nucleotide: contiene le seq. nucleotidiche delle specie caratterizzate, a prescindere che siano o meno codificanti.
• Protein: come Nucleotide, ma relativo alle seq. di amminoacidi.
• PubMed: contiene le pubblicazioni scientifiche di carattere biologico e biomedico.

EMBL-EBI

EMBL-EBI: European Molecular Biology Laboratory, è la più importante organizzazione transnazionale per la ricerca biomolecolare, che ha dato origine all’EBI (European Bioinformatics Institute) il quale gestisce le banche dati europee. Insieme all’EBI collabora il SIB (Swiss Institute of Bioinformatics) nell’annotazione delle seq. proteiche di Swiss-Prot e TrEMBL.

L’EMBL è organizzata in sezioni, in modo da fare ricerche specifiche e più veloci su quelle aree. L’insieme di database gestito da EMBL comprende anche UniProtKB, che integra Swiss-Prot con TrEMBL (compilato grazie alla traduzione delle seq. codificanti prese da EMBL) e con PIR. Su UniProtKB, per ogni sequenza proteica sono riportate le regioni che hanno una funzione, che interagiscono con altre molecole, che possiedono una determinata struttura secondaria o terziaria, ponti disolfuro ecc.

Database secondari

Prosite e Pfam: database secondari contenenti analisi ed elaborazioni derivate dai dati di Swiss-Prot. È messa in evidenza la classificazione dei domini proteici e delle varie famiglie.

Note importanti

Quando una sequenza è inserita nel database, NCBI non controlla se questa sia o meno accurata. Le annotazioni dei geni e dei genomi sono fatte da ricercatori e solo alcune importanti sequenze (le “sequenze di riferimento”) sono curate da esperti di GenBank. Ciò che ne viene fuori è che la struttura di uno stesso gene riportato può essere diversa a seconda del laboratorio che fa le analisi. Inoltre, ogni genoma può avere polimorfismi su uno o più nucleotidi e lo splicing alternativo può portare a versioni differenti dello stesso gene.

PubMed

Le singole citazioni bibliografiche sono organizzate in campi. Utile notare che: gli MeSH, detti “medical subject headings” sono praticamente degli hashtag che rappresentano l’argomento del singolo articolo; l’abstract è il riassunto di quanto riportato; il tipo di pubblicazione può variare tra lettera, editoriale, rassegna; ogni articolo ha il suo numero identificativo, riportato a fianco alla scritta “PMID”; sotto l’autore è riportata la rivista, l’anno, il volume, il fascicolo, la pagina.

Per la ricerca

• Usare l’asterisco * quando si vuole troncare una parola in modo da cercare tutte quelle che hanno come radice ciò che c’è prima dell’asterisco. Attenzione agli spazi, se scrivo qualcosa come “infection*” non troverò “infection control” perché vi è lo spazio in mezzo.
• Usare le virgolette “ “ e scrivere all’interno la frase che si vuole cercare, se si vuole cercare una specifica frase.
• Usare ? per trovare tutte le parole che hanno solo quel carattere differente tra loro. Es, cercare Nure?berg troverà “Nuremberg” e “Nurenberg”.
• Nella sezione Advanced, nella parte Advance Search Builder si trovano funzioni per affinare la ricerca. La funzione Search Builder permette di fare ricerche usando sia termini che operatori booleani (AND, OR o NOT).
• Quando si cerca una parola scrivere a fianco, tra parentesi quadre [au] se si vuole cercare un autore che come nome ha quella parola o [ti] se si vogliono cercare citazioni di articoli il cui nome contiene quella parola. Es. liver [au]

PubChem

Banca dati facente parte del gruppo NCBI, contenente info e strutture su piccole molecole quali i farmaci chimici e naturali (small molecules), quindi non ci troverò macromolecole come le proteine. Il sito contiene una funzione “Draw structure” per disegnare la molecola e quindi ricercarla per struttura. Se non si vuole disegnare la molecola e si ha lo SMILE si può mettere questo e sarà il sito stesso a disegnare e cercare la molecola. PubChem mette a disposizione diversi formati di file per la visualizzazione della struttura 2D e 3D della molecola cercata, tra cui i formati SDF, SMILE (lo SMILE si trova a parte, più in basso nella pagina con tutte le info), JSON, XML e ASNT. L’ISOMERIC SMILE contiene, rispetto allo SMILE, anche informazioni sui centri chirali. Sono presenti, comunque, dei visualizzatori 3D e 2D nella pagina stessa, in più vi sono info come le proprietà fisico-chimiche, nomi e identificatori, info spettrofotometriche, composti simili affiliati, venditori, info sull’utilizzo medico del composto, farmacologia e biochimica, rischi, tossicità, disordini e malattie associate, letteratura e altro.

PDB: Protein Data Bank

Contiene le strutture 3D delle proteine, determinate ottenendo le coordinate spaziali dei singoli atomi tramite cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR su proteine cristallizzate. È possibile scaricare le strutture in diversi formati, in particolare vi è il formato PDB e la sequenza FASTA. Anche qui è presente un visualizzatore 3D, ben più complesso di quello di PubChem, che permette di vedere anche come la proteina interagisce col farmaco e quali tipi di legami vi sono tra i due. Sono riportate info come la classificazione della proteina (es. ossidoriduttasi), quando l’entry è stata depositata e da chi, info sui metodi di ottenimento della struttura (es. diffrazione X-RAY), la risoluzione, letteratura varia, le catene di cui è composta la proteina, la lunghezza delle sequenze, l’organismo da cui deriva, link della stessa proteina su UniProtKB, vari possibili ligandi conosciuti della proteina, altre info varie.

Tools informatici

I file delle banche dati non sono sempre chiaramente leggibili dalle persone, perciò si utilizzano dei programmi per interpretarli. Es. BLAST per lo screening di banche dati, ClustalW, ProbCons e altri per l’allineamento multiplo di sequenze, tool per l’identificazione di esoni ed elementi regolativi che caratterizzano un gene, come GenScan e altri. Ovviamente è importante conoscere anche i vari formati di file.

Tools

• PyMOL - Istruzioni che non ricordo mai:
• Per poter modificare la conformazione di un oggetto nello spazio, o la sua posizione rispetto ad altre molecole, bisogna selezionare la modalità 3D Button Motions dal menu Mouse nella barra dei comandi nella finestra esterna di PyMOL. Tenere premuto Ctrl e selezionare col tasto destro la parte del legame nella quale si ha interesse: comparirà un cerchio bianco e muovendo il mouse il legame selezionato ruoterà. Tenendo premuto Ctrl e selezionando un atomo col tasto sinistro del mouse, spostando il mouse l’atomo verrà trascinato in giro come se si stesse tirando un elastico. Tenendo premuto Ctrl e selezionando col tasto destro la label di un atomo, questa potrà essere spostata. Tenendo premuto Shift e selezionando la molecola premendo con la rotellina del mouse è possibile spostare la molecola a destra e sinistra nello spazio, cambiando così la posizione rispetto ad un’altra. Sempre tenendo premuto Shift è possibile, col tasto sinistro, ruotare la molecola in senso orario o antiorario, mentre col destro è possibile spostarla avanti e indietro rispetto al piano dell’osservatore. I comandi sono comunque scritti nel riquadro in basso a destra del visualizzatore di PyMOL.
• Se metto show -> valence i legami mostrati non saranno più singoli a prescindere; se ci sono doppi o tripli legami questi verranno ora invece visualizzati come tali.
• Se caricata una proteina metto direttamente show -> cartoon anziché mettere show as -> cartoon le strutture secondarie verranno visualizzate in cartoon, in mezzo alle catene laterali (side chains) che resteranno in stick o qualunque fosse il tipo di visualizzazione iniziale. Se metto show as mi fa vedere “tutto” in cartoon e siccome questo comando funziona solo su alfa eliche, beta foglietti e “loop”, tutto il resto scompare. In generale, se voglio far scomparire le side chains devo andare in hide -> side chain.
• Selezione: In generale per selezionare le cose si usa il comando “select” seguito da una parola che indica il tipo di cosa da selezionare. Se voglio selezionare atomi specifici scriverò per esempio “select element S” per selezionare tutti gli atomi di zolfo; per i residui scriverò per esempio “select resn NAG” per selezionare tutti i NAG; per selezionare più residui scrivere i nomi dei residui separati solo da un + e niente spazi, per es. “select resn LEU+HIS”; per selezionare una delle catene della molecola digitare “select chainCATENADIINTERESSE, 2hiu and chainCATENADIINTERESSE”. Per es. select chain A, 2hiu and chain A. Scrivere solo “select chain A” sembra dare, visivamente, lo stesso risultato dello scrivere select chain A, 2hiu and chain A, ma il problema è che la selezione col comando completo risulta essere di 312 atomi rispetto ai 624 del select chain A. Sicuramente l’and agisce come operatore booleano, perciò quel che c’è dopo la virgola definisce come va fatta la selezione: sono selezionati gli atomi che rappresentano un’intersezione degli insiemi proteina e catena A, ovvero sono selezionati gli atomi comuni ad entrambi. Altri tipi di selezione: atomi per nome, scrivendo qualcosa tipo “select mainchain, name N+CA+C+O”, in modo da selezionare gli atomi della catena principale in base al nome; residui per numero, con qualcosa come “select domain 1, resi 33-126” per selezionare i residui dal 33 al 126 del dominio 1; per struttura secondaria, con qualcosa come “select allSTR, h+s+l+”, in modo da selezionare nell’oggetto allSTR rispettivamente le alfa eliche, i beta sheet e i loop; atomi per numero usando qualcosa come “select ID 23”; per b-factor, usando qualcosa come “select gnesh, b>10”; per occupancy, con “select gnesh, q < 0.5”
• Allineamento: Assicurarsi prima di tutto che le molecole che devono essere allineate tra loro siano visibili (se il tasto che le identifica è “spento” e non si vedono non sarà possibile selezionarle per l’allineamento). Se le molecole hanno parti in posizioni simili è possibile allinearle andando su Action -> align -> to molecule -> molecolaDiInteresse.
• Log: se per esempio voglio sapere quanti atomi ho selezionato con il mouse utilizzando per esempio la selezione dei residui posso premere Esc per mostrare il log dell’azione appena compiuta. Questo log mostrerà tutti i comandi eseguiti, non solo quelli dati dalla riga di comando come succede nel log della riga di comando.
• Riportare alla posizione originale: posso andare su action e premere “reset matrix” per riportare l’oggetto alla sua posizione iniziale nello spazio.
• Copiare un pezzo di molecola: selezionare il pezzo e andare su action -> copy to object. In questo modo si avrà una copia di quella selezione indipendente dal resto della molecola, esistente come oggetto a sé stante.
• Frog2: si tratta di un programma utile per capire un po’ come funziona la generazione di conformeri e la ricerca della struttura a più bassa energia.
• https://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/Frog2/
• ChemDraw: si tratta di un programma online utile per disegnare schemi di reazioni chimiche varie che mette a disposizione anche tutto un set di “BioArt” per creare rappresentazioni di processi vari.
• https://chemdrawdirect.perkinelmer.cloud/js/sample/index.html
• OpenBabel: si tratta di un programma, disponibile da installare e online, per convertire un determinato tipo di file in un altro. È disponibile una miriade di formati, tra cui SMILE, pdb, mol, mol 2, xyz. Basta prendere lo smile o il file, metterli nell’apposita casella di input e selezionare, nel menu al centro della schermata, quale formato si vuole in output, se si vogliono coordinate 2D o 3D e se si vogliono aggiungere o rimuovere gli idrogeni.
• http://www.cheminfo.org/Chemistry/Cheminformatics/FormatConverter/index.html
• SwissADME: programma utile per calcolare le proprietà ADME di una determinata molecola. Si può inserire lo SMILE. Permette in generale di predire alcune delle proprietà drug like, come il logP, se segue la regola del 5 di Lipinski o quella di Veber, la superficie polare, pH, inibizione del CYP450 ecc.
• Molprobity
• SwissModel: Si tratta di un programma utilizzato per ottenere strutture terziarie per omologia, quindi adatto a sequenze target che hanno sequenze simili da qualche parte nei database. Data la sequenza target (formato FASTA?), il programma va a selezionare il template che sembra migliore tra quelli conosciuti, fa l’allineamento, crea un modello e lo valuta. Bisogna fare attenzione al QMEAN, in genere se il pollice è all’insù vuol dire che il modello è buono. Il QMEAN è una funzione di punteggio che descrive i principali aspetti geometrici delle strutture proteiche, che sfrutta 5 diversi descrittori strutturali. Le sequenze sono in genere colorate di rosso o blu. Blu significa che l’allineamento è riuscito meglio, più si va sul rosso e peggio è.
• LigandScout

Formati dei file

• MDL MOL (.mol): codifica gli atomi, le loro coordinate e i legami che ci sono tra loro. Il file contiene delle righe di intestazione, la connection table contenente info sugli atomi, una sezione dedicata ai legami tra atomi e sezioni aggiuntive che contengono info più complesse. I formati .mol si concludono con la dicitura “M END” seguita, a capo, da 4 simboli di dollaro.
• MOL 2 (.mol2): la sezione iniziale (righe dalla 8 alla 14) contiene le info generali della molecola. La seconda sezione, una tabella larga, contiene le info sugli atomi della molecola. La terza sezione, un’altra tabella più stretta, contiene le info sui legami. La sezione successiva contiene info necessarie a ricostruire le varie sottostrutture.
• XYZ(.xyz): è un file relativamente piccolo rispetto agli altri, che contiene giusto la tabella con il numero degli atomi e il tipo di atomo e le loro coordinate. Contiene, nelle righe iniziali, info come il titolo, il commento o il nome del file. I valori delle coordinate sono in Angstrom.
• Structure Data FormatSDF (.sdf): è un’estensione del formato MOL adatta a rappresentare info aggiuntive più complesse e a gestire insiemi di molecole. Le varie sezioni dopo la tabella principale sono delineate tipo “><nomedellasezione>”. Il file si conclude con i 4 dollari del .mol.
• Simplified Molecular Input Line EntrySMILE: rappresenta la molecola utilizzando una sola riga di testo, seguendo delle regole ben precise per rappresentare i legami tra gli atomi. Le stringhe SMILE codificano tipi di atomi e legami tra loro ma non contengono coordinate 2D o 3D. È tutto su una linea di testo e questo testo può essere convertito in strutture 2D. Gli atomi di idrogeno non sono rappresentati, mentre gli altri sono rappresentati dal loro simbolo chimico. Il legame singolo non è segnalato, semplicemente gli atomi sono scritti affiancati. Il doppio legame è segnalato dal simbolo “=” mentre il triplo dal “#”. I gruppi di atomi sono racchiusi tra parentesi. I cicli sono espressi partendo dal primo atomo del ciclo, che risulta anche essere l’atomo con cui il ciclo si chiude. Il primo atomo è accompagnato da un numero che identifica il punto di chiusura del ciclo.