Riassunto esame Istologia, Prof. Di Agostino Silvia, libro consigliato Istologia , Monesi

Istologia

Che cos’è l’istologia? L’istologia è lo studio dei tessuti, questi sono un insieme di cellule simili tra di loro che si organizzano per una specifica funzione. Le cellule si organizzano dunque in una determinata struttura ed in base alla loro morfologia si riesce anche a capire la funzione della struttura.

La teoria cellulare nasce a metà dell’800 grazie allo scienziato Schwann, da cui prendono il nome le cellule di Schwann. Teoria secondo cui la cellula è la più piccola unità funzionale che si può trovare nell’organismo. Esistono cellule eucariotiche che sono unicellulari, come ad esempio i lieviti, esse riescono a vivere da sole o possono anche aggregarsi tra di loro.

Tante cellule diverse tra loro formano un tessuto ed a loro volta i tessuti possono aggregarsi e formare organi, ad esempio il cuore è formato da tessuto muscolare ossia il miocardio, tessuto epiteliale, l’epicardio ed una membrana di tessuto connettivo. L’insieme di organi formano un apparato: es. apparato urinario composto da rene, vescica, uretere ecc.

Gli strumenti per l’analisi microscopica

La maggior parte delle cellule è talmente piccola da non poter essere osservata a occhio nudo; il limite visibile per l’occhio umano è infatti di 0,2 mm. Per vedere chiaramente una cellula si utilizza uno strumento che ingrandisce l’immagine: il microscopio.

Esistono diversi tipi di microscopio:

• Microscopio ottico
• Microscopio elettronico

Microscopio ottico

In questo apparecchio dotato di lenti per ingrandire e focalizzare l’immagine, la luce passa attraverso il materiale animale o vegetale da esaminare, il cosiddetto «campione». Proprio perché deve essere attraversato dalla luce, il campione deve essere molto sottile. Talvolta, per poter mettere in evidenza alcuni particolari, i campioni vengono colorati artificialmente.

Un buon microscopio ottico può ingrandire un oggetto circa 1500 volte. Qualsiasi microscopio ottico non permette di distinguere dettagli minori di 0,2 μm, circa le dimensioni dei batteri più piccoli; di conseguenza, indipendentemente da quanto si ingrandisce l’immagine dei batteri, il microscopio ottico non permette di osservarne le strutture interne.

Microscopio elettronico

A metà del XX secolo, le conoscenze sulle strutture cellulari hanno fatto notevoli passi avanti grazie all’invenzione del microscopio elettronico, uno strumento che impiega, al posto della luce, un fascio di elettroni, che viene generato dal catodo e sottoposto ad un campo elettrico.

I microscopi elettronici ingrandiscono i campioni molto di più di quelli ottici, ma al contrario di questi ultimi non possono essere utilizzati per osservare cellule vive. Esso presenta due tipologie:

• Microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Per osservare i particolari della struttura interna delle cellule si utilizza il microscopio elettronico a trasmissione. In questo strumento, che impiega un fascio di elettroni invece della luce, le lenti di vetro sono sostituite da elettromagneti. Essi deviano il fascio di elettroni per ingrandire e mettere a fuoco l’immagine su uno schermo o su una lastra fotografica. Per poter essere attraversato dagli elettroni, il campione preparato per il microscopio elettronico a trasmissione deve essere estremamente sottile.
• Microscopio elettronico a scansione (SEM). Per studiare le strutture presenti sulla superficie delle cellule si utilizza un tipo particolare di microscopio elettronico, chiamato microscopio elettronico a scansione. A questo scopo, le cellule vengono ricoperte con un sottilissimo strato di metallo che impedisce l’accumulo di carica elettrica e di energia termica nel campione. Quando il metallo viene colpito dagli elettroni, a sua volta ne emette altri che formano un’immagine della superficie esterna delle cellule. Le immagini prodotte da questo tipo di microscopio appaiono tridimensionali, in quanto gli elettroni non attraversano il campione ma rimbalzano.

I parametri fisici nella microscopia ottica

I parametri fisici nella microscopia ottica sono:

• L’ingrandimento
• Il potere di risoluzione
• La diffrazione, spesso si genera a causa degli artefatti e dei tagli troppo spessi.

Il potere di risoluzione di un microscopio è definito come la distanza minima alla quale due punti risultano distinti, ed esso dipende dalla luce e dall’apertura della lente.

L’ingrandimento è invece il rapporto tra la dimensione dell’immagine vista al microscopio e la dimensione reale dell’oggetto. Quando indichiamo i nomi degli obiettivi con i termini 40×, 20×, 10× si intende che l’oggetto è stato ingrandito 40, 20 o 10 volte rispetto alla sua reale dimensione.

Con l’aumentare dell’ingrandimento, il diametro di campo si restringe e diminuisce la possibilità di dedurre la forma generale degli oggetti di maggiori dimensioni. Quindi possiamo dire che cambierò l’obiettivo del mio microscopio a seconda dell’interesse di osservazione.

Il fenomeno fisico della diffrazione si ha ogni volta che la luce incontra un ostacolo o un’apertura di dimensioni paragonabili alla sua lunghezza d’onda. L’effetto della diffrazione è quello di allargare il fascio di luce originario dando origini a immagini non più risolvibili quindi non separate fra loro.

La preparazione di un campione biologico per la microscopia ottica

La preparazione di un campione biologico per la microscopia ottica è suddivisa in varie fasi:

• Il campione viene preso a fresco tramite biopsia o intervento chirurgico.
• Appena il campione viene asportato iniziano subito i processi di degradazione ed esso potrebbe andare in necrosi e per evitare ciò deve essere fissato per immortalare la situazione proteica e del DNA o dell’RNA in quel momento. Il campione viene fissato in una cappa con l’aria che viene aspirata perché per fissarlo è necessario l’utilizzo di sostanze organiche neurotossiche come formaldeide, paraformaldeide, metanolo e alcoli. I reagenti formano legami covalenti tra le molecole che così non sono più attaccabili da substrati enzimatici che le potrebbero degradare.
• A questo punto il campione, che è ancora molle, si deve includere in una matrice dura per poter essere tagliato. Iniziano così i passaggi di inclusione: prima di tutto il campione va disidratato; per togliere l’acqua si fanno dei passaggi in soluzioni crescenti di etanolo, che elimina l’acqua e si sostituisce ad essa. Si parte da soluzioni di etanolo 20%, 30%, 50% fino ad etanolo 100%, in cui tutto il campione avrà l’acqua sostituita con l’etanolo. Poi seguono dei passaggi con un solvente organico che è lo xilolo o lo xilene al fine di eliminare l’etanolo, perché il passaggio successivo viene fatto in paraffina che non presenta affinità per l’etanolo. Anche in questo caso, si effettuano dei passaggi a concentrazioni crescenti e lo xilene spazza l’etanolo per cui, alla fine della disidratazione, si avrà un blocchetto in xilene/xilolo che verrà incluso in paraffina.

Coloranti istologici

Il nostro organismo è costituito al 70% di acqua. Le cellule in esso presenti mostrano di conseguenza al loro interno una organizzazione delle molecole tale da renderle traslucide. Essendo sostanzialmente trasparenti, cioè completamente attraversabili dai raggi di luce, esse sono quindi di fatto invisibili al microscopio.

Per questo motivo sono state individuate, fin dagli inizi del XVII secolo, una serie di sostanze capaci di colorare varie porzioni della cellula, rendendole così visibili. La maggior parte dei coloranti usati in istologia è rappresentata da molecole idrosolubili e quindi disciolte in acqua.

Le sezioni da colorare sono, invece come abbiamo già detto, imbevute di paraffina e perciò impermeabili all’acqua in cui i coloranti sono disciolti. Per colorare le sezioni occorre quindi preliminarmente rimuovere la paraffina, con l’uso di xilolo, e reidratare il tessuto attraverso un progressivo passaggio in alcool etilico sempre più diluito in acqua, fino ad immergerle in acqua.

Per molti di questi coloranti non è noto il meccanismo attraverso cui si legano a particolari strutture o molecole. Per altri invece si conosce il carattere genericamente elettrostatico del legame; un esempio sono i coloranti basici come l’ematossilina, che ha un’affinità per molecole acide come il DNA o coloranti acidi come l’eosina, che si legano a molecole basiche, come molte proteine citoplasmatiche.

Queste caratteristiche tintoriali hanno quindi portato a definire alcune strutture cellulari o extracellulari come acidofile o basofile, in base alla loro colorabilità con coloranti acidi o basici rispettivamente. In istologia vengono comunemente impiegate miscele di vari coloranti per mettere in evidenza i diversi costituenti delle cellule e dei tessuti.

La combinazione più comunemente impiegata è la miscela ematossilina-eosina nella quale l’ematossilina colora in blu la cromatina del nucleo e l’eosina in varie gradazioni di rosa-rosso alcune parti del citoplasma. Altre miscele coloranti comunemente impiegate sono quella di Giemsa, blu di metilene, eosina ed azzurro II, e l’RNA in rosso, pironina; il metodo tricromico di Mallory; il metodo di Masson; il metodo Azan; ecc.

L’orceina in soluzione acetica viene spesso usata per lo studio dei cromosomi. Per la dimostrazione di costituenti particolari delle cellule fissate; quali i mitocondri, i centrioli, l’apparato di Golgi, le fibre elastiche, le fibre reticolari, ecc., debbono essere impiegati metodi di colorazione speciali.

Un accenno particolare merita il cosiddetto fenomeno della metacromasia. La metacromasia consiste nella proprietà che hanno alcuni composti chimici di assumere con certi coloranti basici del gruppo della tiazina, specialmente il blu di toluidina, la tionina, l’azzurro A, una colorazione diversa dalla tinta del colorante impiegato, rosso violetto con il blu di toluidina, per esempio.

Questi coloranti hanno un caratteristico colore blu, ortocromatico, quando sono diluiti in soluzione, allo stato monomerico; se invece si legano in grande quantità a un substrato, formando dimeri e polimeri, assorbono la luce ad una più bassa lunghezza d’onda ed appaiono di colore rosso, metacromatico.

Questa reazione si verifica con sostanze di alto peso molecolare che presentano molti gruppi anionici liberi quali i glicosamminoglicani acidi della sostanza fondamentale dei tessuti connettivi, soprattutto il condroitin solfato della cartilagine, dei mastociti e dei leucociti basofili, ed in grado minore gli acidi nucleici ed alcuni lipidi acidi.

Esiste una grande varietà di coloranti, la cui denominazione spesso non è legata alla loro composizione chimica, ma che possono essere impiegati per meglio rendere visibile questo o quel tessuto o singolo tipo di cellula o diverse componenti interne alla stessa cellula.

Alcuni coloranti detti vitali hanno la proprietà di essere assunti elettivamente da alcune cellule viventi permettendo così la loro identificazione o lo studio di funzioni particolari. Quando il colorante vitale è iniettato nell’animale intero si parla di colorazione vitale; se invece esso è somministrato a cellule o a tessuti isolati dall’organismo, per esempio al liquido nutritivo in colture in vitro, si usa il termine di colorazione sopravitale.

L’alizarina, usata come colorante vitale, è incorporata elettivamente nella sostanza fondamentale dell’osso in corso di calcificazione, colorandola in rosso. L’impiego di questo colorante ha favorito gli sviluppi delle conoscenze sui processi di ossificazione. Il colorante sopravitale verde Janus colora elettivamente i mitocondri in virtù delle proprietà ossido-riduttive di questi organuli.

Il rosso neutro, usato come colorante vitale, è concentrato elettivamente nei granuli specifici dei leucociti colorando quelli dei neutrofili in rosa, quelli degli eosinofili in giallo ed i granuli basofili in rosso mattone. Il blu di metilene colora vitalmente l’assone delle cellule nervose.

Metodi istochimici di colorazione

Accanto ai metodi di analisi biochimica se ne sono sviluppati altri di tipo istologico che consentono di identificare e di localizzare le sostanze chimiche all’interno della cellula intatta, metodo di analisi chimica in situ. Tale tipo di analisi prende il nome di Citochimica, o in termini più generali, di Istochimica se si prefigge il compito di localizzare sostanze chimiche non solo nelle cellule ma anche nei costituenti intercellulari dei tessuti.

L’ematossilina, ad esempio, lega il DNA e quindi colora intensamente il nucleo della cellula, dove questa importante molecola è presente ad un’altissima concentrazione. Ma l’ematossilina colora allo stesso modo qualsiasi altra molecola ricca di cariche negative, compresi gli altri tipi di acidi nucleici o proteine acide.

Sono stati quindi sviluppati una serie di metodi e colorazioni per evidenziare singole categorie di molecole e poterle così localizzare nei tessuti. Tra i vari costituenti chimici della cellula:

Lipidi

La colorazione dei lipidi generalmente sfrutta la loro proprietà di assumere certi coloranti solubili nei grassi, Sudan Nero B, Blu Nilo, Sudan III.

Carboidrati

La colorazione più nota per mettere in evidenza i polisaccaridi è la reazione acido periodico-Schiff, reazione PAS. Tale reazione consiste in un trattamento preliminare delle sezioni istologiche con acido periodico che ossida i gruppi 1,2-glicol degli zuccheri in gruppi aldeidici e nella successiva colorazione dei gruppi aldeidici così liberati con il reattivo di Schiff che reagisce selettivamente con essi.

Mucosa intestinale colorata con la reazione PAS. Quando vedo delle cellule colorate di blu scuro o violaceo vuol dire che è stata usata la colorazione PAS e che esse sono cellule mucipari. Fegato: metodo al carminio di Best per il glicogeno.

Il reattivo di Schiff, leucofucsina, si ottiene trattando la fucsina basica con acido solforoso. La parafucsina, cloruro di triamino-trifenil-metano, contenuta nella fucsina basica reagisce con l’acido solforoso trasformandosi in un composto incolore, l’acido bis-N-amino-solfonico, reattivo di Schiff.

Il reattivo di Schiff forma un composto di addizione con le aldeidi generando un prodotto finale di reazione di colore rosso magenta. La reazione PAS viene impiegata per mettere in evidenza il glicogeno, l’amido, la cellulosa, le mucine epiteliali, i polisaccaridi neutri, i proteoglicani.

Per distinguere i vari polisaccaridi si possono usare test di digestione enzimatica. Il metodo consiste nel trattare una sezione di controllo, prima della reazione, con un enzima che idrolizzi in maniera specifica la sostanza chimica che si vuol identificare, per esempio, l’enzima amilasi nel caso del glicogeno.

Se il trattamento enzimatico preliminare determina l’abolizione della colorabilità con la reazione PAS, cioè, se la sezione di controllo appare incolore, si concluderà che la sostanza chimica messa in evidenza dalla reazione è effettivamente glicogeno.

Proteine

Le proteine possono essere messe in evidenza con reagenti che formano, con certi gruppi chimici di amminoacidi particolari, prodotti di reazione colorati. Tra i vari metodi vi è la reazione di Millon, nella quale il reattivo nitromercurico si combina con i gruppi della tirosina presenti nelle catene laterali formando un precipitato rosso; la reazione al diazonio che forma complessi colorati con la tirosina, il triptofano e l’istidina; i metodi per la messa in evidenza dei gruppi -SH, tra i quali il metodo di Bennett.

Immunoistochimica

Quando occorre individuare specifiche molecole non dotate di attività enzimatica e quindi non evidenziabili attraverso la propria attività o è necessario distinguere molecole tra loro molto simili dal punto di vista chimico, si ricorre a tecniche di immunoistochimica.

Questo approccio è oramai quello prevalente nell’istochimica e sfrutta la capacità che gli anticorpi hanno di distinguere differenze anche minime tra una proteina e l’altra. Gli anticorpi sono anch’essi proteine normalmente prodotte dagli animali superiori per la difesa verso sostanze estranee che penetrino nell’organismo.

Essi sono in grado di legarsi ad altre proteine in maniera specifica, discriminando anche differenze di pochissimi amminoacidi tra due molecole bersaglio simili. Iniettando in animali la proteina da studiare, induciamo i loro linfociti a reagire contro questa proteina a loro estranea, antigena, producendo anticorpi che specificamente la riconoscono.

L’anticorpo si lega all’antigene, ma essendo esso stesso una molecola non è visibile al microscopio. Occorre quindi rendere visibile l’anticorpo cosicché il suo legame in siti particolari del tessuto possa essere evidenziato.

A questo fine, l’anticorpo può essere modificato attraverso il legame ad esso di molecole di dimensioni ridotte, fluorocromi, che non alterano significativamente la conformazione dell’anticorpo, salvaguardando la sua capacità di legare l’antigene.

I fluorocromi sono anch’essi invisibili al microscopio, ma hanno una caratteristica: se colpiti da raggi di luce di lunghezza d’onda dello spettro non percepibile dall’occhio umano, ultravioletto, per esempio, essi divengono visibili, emettono cioè una luce percepibile dai nostri occhi. Se noi osserviamo ad un normale microscopio un preparato istologico trattato con anticorpi fluorescenti, cioè, modificati con un fluorocromo, non notiamo alcunché di particolare. Ma