Riassunto esame Genetica, Prof. Landi Stefano, libro consigliato Genetica, Zanichelli

Genetica

La genetica è lo studio di tutti gli aspetti della funzione dei geni. I geni sono definiti come unità fondamentali di informazione genetica (paragonati alle parole nel linguaggio del processo vitale). La genomica è lo studio della serie completa di geni di un organismo (definita genoma).

Genoma eucariotico

Negli eucarioti, la maggior parte del genoma si trova nei nuclei, ognuno dei quali ha lo stesso contenuto di DNA. Il DNA nucleare è composto da un numero di cromosomi specie-specifico; nell'uomo ci sono due copie di 23 cromosomi diversi. Il genoma però si può trovare anche nei mitocondri e viene chiamato DNA mitocondriale. Il 93% del DNA mitocondriale ha 37 geni che codificano per proteine; tra un gene e quello accanto non ci sono altre sequenze di DNA.

Cosa opposta avviene nel DNA nucleare, che può avere varie funzioni: 3% sequenze non codificanti, ma che si ritrovano molto simili tra mammiferi o anche tra organismi più distanti, quindi dipende dalla filogenetica (DNA altamente conservato); 6,6% eterocromatina costitutiva (pezzi di DNA che stanno ben condensati in modo permanente); 45% sequenze che nel tempo si sono duplicate e si sono mosse (ripetizioni basate su trasposoni); 44% sequenze che stanno tra un gene e un altro e di cui non sappiamo il significato. Più del 90% del DNA viene detto junk DNA e solo l'1.5% rappresenta DNA codificante (segue, in parte, le leggi di Mendel).

Genoma nucleare umano

3200 Mb (giga = paia di basi); 23 differenti molecole di DNA (lineari) nelle cellule XX, 24 in quelle XY; 46 molecole di DNA per cellula nelle cellule diploidi (varia con la ploidia); diverse classi di istoni e proteine non istoniche; circa 30000 geni; densità genomica: circa 1/100kb; unità di trascrizione monocistronica (maggioranza dei geni viene trascritta individualmente).

Genoma mitocondriale umano

16.6kb (nucleotidi); una molecola di DNA circolare; numerose migliaia di molecole di DNA per cellula; per lo più senza proteine associate; 37 geni; densità genomica: 1/0.45kb; 93% di DNA codificante; unità di trascrizione policistronica (co-trascrizione di più geni di seguito sia dal filamento pesante che da quello leggero).

Numero di cromosomi e struttura

Il numero di cromosomi della serie genomica di base è chiamato numero aploide (n). Gli organismi aploidi (es. funghi) hanno i nuclei che contengono una sola serie di cromosomi. Gli organismi diploidi hanno nuclei contenenti due coppie complete del genoma e quindi due serie identiche di cromosomi; i membri di una coppia di cromosomi sono chiamati omologhi. Le sequenze di DNA di una coppia di omologhi sono praticamente le stesse (stesso ordine dei geni), anche se spesso è presente una variazione minima nella sequenza nucleotidica. Gli esseri umani sono diploidi, con due copie di 23 cromosomi diversi, quindi n = 23 e 2n = 46. Vi sono 22 coppie di autosomi e 1 coppia di cromosomi sessuali (XX femmine, XY maschi).

I cromosomi furono numerati partendo dal fatto che il numero 1 era il più grosso, fino ad arrivare al più piccolo. Gli estremi dei cromosomi sono definiti telomeri, mentre la parte centrale è il centromero. I cromosomi sono formati da due cromatidi fratelli (=contengono esattamente copie identiche dello stesso DNA) uniti per il centromero. Quando si parla di piastra metafasica ci si riferisce alla metafase, momento che dura pochissimo nel ciclo cellulare: il DNA è molto condensato per permettere la trasmissione alle cellule figlie, che erediteranno i cromatidi (il cromatide, nella cellula figlia diventerà 1 cromosoma). A seconda della fase della metafase, i due cromatidi possono anche essere attaccati tra di loro.

Bandeggio cromosomico

Il bandeggio comporta la digestione con enzima che degrada le proteine di rivestimento del cromosoma. Il DNA è impacchettato al massimo alla metafase grazie a proteine che tengono insieme tutto. Se si digerisce con tripsina, le proteine di rivestimento e sostegno vengono meno e quindi ci sono regioni del cromosoma che si disimpacchettano, si rilassano e quindi la colorazione diventa più o meno compatta: la colorazione scura è dovuta al colorante Giemsa (si lega alle matasse compatte) mentre quella chiara è quella che si è rilassata. Questo tipo di pattern è cromosoma-specifico. Un altro tipo di bandeggio è chiamato bandage Q.

Mitosi e meiosi

• Mitosi: divisione nucleare che avviene durante il ciclo cellulare; può avvenire sia in cellule aploidi che diploidi. La mitosi porta alla formazione di due cellule figlie che hanno lo stesso contenuto genomico della cellula progenitrice. Le fasi del ciclo cellulare sono:
  • G0: fase in cui alcune cellule permangono per tutta la loro vita (es. neuroni) oppure quiescenti.
  • G1: i singoli cromosomi sono un filamento per la gran parte srotolato dentro il nucleo (cromatina); il centromero esiste ma non è raffigurabile.
  • S, sintesi: replicazione cromosomica che produce coppie di cromatidi fratelli identici; è semi conservativa: i due cromatidi fratelli di un cromosoma figlio sono uno derivante dalla doppia elica originaria e uno di nuova sintesi. In questa fase i due cromatidi fratelli sono sempre rilassati ma uniti in una regione centromerica.
  • G2: si completa la fase S e ci sono i checkpoint; se qualcosa è andato storto la cellula può andare in apoptosi. Dopodichè c'è la mitosi.

  Oltre alla ploidia c'è da tener conto del contenuto del DNA (≠ n° cromosomi): se in G1 il contenuto è C, dopo aver duplicato il DNA il contenuto sarà 2C; si hanno ancora 2n cromosomi ma ognuno è stato duplicato quindi la quantità di DNA complessivo è raddoppiata. Con la divisione, ogni cellula figlia sarà di nuovo C.

  Fasi della mitosi:

  • Profase: si distingue in precoce e avanzata. Nella profase precoce si iniziano a distinguere i cromosomi; nella profase avanzata i cromosomi sono visibili e appaiono in una struttura doppia (2 cromatidi fratelli uniti dal centrosoma).
  • Metafase: il fuso è ben evidente e i cromosomi si muovono verso il piano equatoriale della cellula, dove una fibra del fuso proveniente da ogni polo si attacca ai centromeri.
  • Anafase: le coppie di cromatidi fratelli si separano e ogni cromatidio si sposta verso un polo, diventando il cromosoma figlio.
  • Telofase: i cromosomi despiralizzano e riappaiono i nucleoli.
• Meiosi: cellule diploidi specializzate (meiociti) sono separate dalle altre e si dividono per produrre cellule sessuali; avvengono due divisioni cellulari in sequenza e le due divisioni nucleari che le accompagnano costituiscono la meiosi. La meiosi avviene solo nelle cellule diploidi e porta alla formazione di quattro cellule aploidi. Prima della divisione avviene la replicazione cromosomica che origina i cromatidi fratelli. Durante l'interfase i cromosomi omologhi non sono strettamente appaiati. Il nucleo interfasico comunque presenta dei domini cromosomici.

La meiosi è costituita da due divisioni distinte in meiosi I e meiosi II ed ognuna delle due è divisa in profase, metafase, anafase e telofase.

Meiosi I

• Profase I:
  • Leptotene: i cromosomi diventano visibili come lunghi filamenti sottili; iniziano a contrarsi e lo fanno per tutta la profase.
  • Zigotene: i cromosomi omologhi cominciano ad appaiarsi e si ha la formazione del complesso sinaptonemale. L'unione delle coppie omologhe è chiamata sinapsi; ogni coppia è detta diade e l'unità che comprende la coppia di diadi unite è detta bivalente. I quattro cromatidi che compongono il bivalente sono chiamati tetrade (quattro unità omologhe).
  • Pachitene: i cromosomi sono spessi e completamente uniti nella sinapsi; il numero delle coppie omologhe di cromosomi è uguale al numero n.
  • Diplotene: ogni cromosoma diventa visibilmente una coppia di due cromatidi fratelli. Gli omologhi appaiati si allontanano leggermente (desinapsi), e si formano una o più strutture a forma di X chiamate chiasmi tra i cromatidi non fratelli. Questi punti sono quelli dove avviene il crossing over (scambio di materiale genetico); in questa fase quindi non si avranno più i cromatidi fratelli ma cromatidi ricombinanti/omologhi (non cambia l'ordine dei geni perché i cromosomi omologhi continuano ad avere lo stesso ordine → 1° motore per la variabilità).
• Metafase I: diacinesi (movimento di separazione). I cromosomi sono ben condensati e si dissolve l'involucro nucleare. Ogni coppia di omologhi si posiziona sul piano equatoriale della cellula. In questo stadio i centromeri non si separano; questa mancanza di divisione costituisce una delle principali differenze con la mitosi.
• Anafase I: i cromosomi omologhi (ognuno costituito da due cromatidi ricombinanti) migrano verso i poli opposti della cellula.
• Telofase I: i cromosomi si allungano e si decondensano, la membrana nucleare si riforma e la cellula si divide. Le due cellule figlie di questa divisione avranno una quantità di DNA pari a C con ploidia n = 23.
• Interfase/intercinesi: non c'è duplicazione del DNA; lo stato genetico dei cromosomi non cambia.

Meiosi II

• Profase II: le coppie di cromatidi fratelli, presenti in numero aploidi, sono in uno stato condensato.
• Metafase II: le coppie di cromatidi ricombinanti si dispongono sul piano equatoriale.
• Anafase II: i cromatidi ricombinanti si separano e diventano cromosomi a tutti gli effetti.
• Telofase II: i cromosomi si raccolgono entro nuovi nuclei e anche il resto della cellula si divide.

A causa del crossing over e dell'assortimento indipendente, ogni nuova cellula avrà un suo peculiare corredo genetico (aploide, con contenuto C/2).

Ciclo vitale

Il ciclo vitale non è uguale per tutti gli organismi. L'uomo ha ciclo vitale diploide: in un certo momento vengono prodotti gameti, unico momento aploide; dopodiché avviene la fecondazione, quindi la formazione dello zigote diploide. Altri organismi, come le piante, hanno una fase aploide più lunga: le cellule n non vanno subito incontro a fecondazione ma verso una fase mitotica, che andrà a maturare i gametofiti. Altri organismi, come i funghi, sono aplodiplonti: hanno vita vegetativa di tipo n, formano dei miceli che possono decidere di costruirsi in una sorta di spora in grado di essere diffusa per la colonizzazione (aploide) oppure differenziarsi in un gamete e andare a formare il diploide; spesso la fase diploide è quella breve.

I funghi ascomiceti sono stati usati come modello per studiare la ricombinazione. Neurospora crassa è aploide in gran parte del ciclo vitale quindi l'interpretazione genetica dei risultati risulta immediata in quando non vi sono rapporti di dominanza-recessività. Una caratteristica unica di Neurospora è la disposizione delle spore prodotte dalla meiosi di un solo nucleo diploide nell’apposito involucro (asco). Le spore sono disposte linearmente nell’ordine in cui sono state prodotte con le divisioni meiotiche. Con la possibilità di separare le spore precisamente e di studiarle singolarmente, i ricercatori hanno un modello ideale per l’analisi della ricombinazione meiotica.

Ciclo di Neurospora

• Ciclo asessuato: inizia con le spore aploidi rilasciate dai microconidi e dai macroconidi. Quando la spora germina, dall’estremo in crescita si allunga una proiezione tubolare che porta alla formazione di un aploide micelio, contenente le ife ramificate. La crescita avviene mediante la replicazione e divisione dei nuclei aploidi e non è accompagnata dalla formazione di setti cellulari. Sulle piastre Petri, la rete compatta di filamenti produce una colonia. Di fatto questa rete di ife in una colonia è essenzialmente una sola grande cellula continua, con molti nuclei aploidi. La colonia aploide sporula formando i sacchi dei conidi e una colonia può produrre milioni di spore.
• Ciclo sessuato: due diversi alleli del gene del tipo sessuale, MATA e MATa, controllano il ciclo sessuale delle spore di Neurospora. Le spore contengono l’allele MATA o MATa e il contatto tra le colonie dei diversi tipi sessuali porta alla fusione della parete cellulare seguita dalla fusione dei nuclei aploidi. I nuclei diploidi ottenuti vanno velocemente incontro a divisioni meiotiche e ogni nucleo diploide produce quattro spore che vanno incontro a un’altra divisione mitotica, producendo otto spore aploidi in un asco. Le spore aploidi sono disposte secondo la loro origine cellulare, e s’impilano in fila all’interno di un asco lungo e sottile. Più aschi sono contenuti in una struttura detta peritecio. Ogni spora nel peritecio è aploide e può formare un’altra colonia di Neurospora. La spora svela subito il suo genotipo, essendo aploide; quindi, si otterrà un asco con spore di vari colori distribuite con la regola dell'ottetto (es. chiare-chiare, scure-scure).

Fu notato che alcune coppie figlie non rispettavano questa regola e fu ipotizzato che fosse a causa di mutazioni; però, la normale frequenza delle mutazioni è raramente superiore a 10^-6. Si capì quindi che alla base c'era un meccanismo di ricombinazione.

Ricombinazione genetica

Vi sono molti modelli validi che spiegano il meccanismo della ricombinazione; per esempio, il modello non reciproco con ansa a D oppure il modello reciproco.

Modello reciproco della ricombinazione

Le due molecole omologhe si appaiano e la ricombinazione inizia con l’introduzione di rotture a singolo filamento. I filamenti incisi possono staccarsi dal filamento complementare della stessa molecola di DNA e invadere la doppia elica di DNA omologa appaiandosi al filamento complementare. L’invasione è simmetrica e porta alla formazione di una giunzione di Holliday; essa può ora scorrere sul DNA mettendo di fronte nei due filamenti di DNA sequenze non identiche, formando delle regioni chiamate "eteroduplex".

Per terminare l’evento di ricombinazione, la giunzione deve essere risolta tagliando e risaldando i filamenti di DNA prodotti. Per visualizzare meglio i siti di taglio la giunzione viene ruotata dando origine a una struttura planare in cui i filamenti non sono più intersecati tra loro. Il sito di taglio indicato con X coinvolge i due filamenti di DNA che all’inizio dell’evento ricombinativo non erano rotti. Al contrario, il sito di taglio indicato con Y avviene sui due filamenti di DNA che erano stati rotti per iniziare la ricombinazione. Dopo la risoluzione della giunzione e la saldatura dei filamenti tagliati si generano prodotti diversi a seconda che il taglio sia avvenuto nella posizione X oppure nella posizione Y. Nel primo caso le molecole di DNA ricombinanti prodotte (definite "prodotti del crossing over" o "splice") hanno portato a un riassortimento degli alleli adiacenti al sito di ricombinazione, perché vi è stato uno scambio tra i geni A e C. Nel caso in cui il taglio avvenga nella posizione Y, le molecole di DNA ricombinanti contengono un ibrido chiamata "patch". Tale taglio non porta al riassortimento dei geni fiancheggianti la porzione di DNA giunzione e dà origine a prodotti definiti "prodotti del non-crossing over".

Il DNA eteroduplex si forma in tante circostanze nelle varie fasi dei meccanismi cellulari. È però stato caratterizzato per la prima volta nella ricombinazione meiotica, quando durante la formazione del chiasma, uno dei due semifilamenti viene congiunto con l'altro semifilamento e viene fatto scorrere: i due non sono perfettamente complementari quindi ci sono dei punti di mismatch (disappaiamenti). Dopo che la struttura di Holliday è stata risolta, la cellula si porta dietro per un certo periodo di tempo il DNA eteroduplex, ma non per molto, perché ci sono i sistemi di riparazione del DNA che vigilano sulla fedeltà delle azioni fatte dal DNA. Quando viene riconosciuto l'errore (es. una C e una G che non si appaiano), i sistemi di riparazione intervengono per ripararlo. In maniera casuale, un filamento viene riparato e il DNA eteroduplex diventa corretto (es. la coppia che non si appaiava si cambia e si mettono G e C che si appaiano). Questo meccanismo è chiamato conversione genica.

DNA: struttura e replicazione

Il materiale genetico, per essere definito tale, deve avere tre caratteristiche fondamentali:

1. Le proprietà strutturali del DNA devono consentire una replicazione fedele a ogni divisione cellulare, poiché tutte le cellule del corpo di un organismo devono avere lo stesso contenuto genetico.
2. Deve avere un contenuto di tipo informativo, poiché deve codificare un enorme numero di proteine.
3. Deve essere relativamente stabile affinché gli organismi possano dare affidamento sull'informazione, ma deve anche essere in grado di modificarsi in rare occasioni (mutazioni = materiale grezzo per la selezione evolutiva).

Dal punto di vista chimico il DNA contiene tre tipi di componenti: 1) un gruppo fosfato in posizione 5' (può essercene da uno a tre); 2) uno zucchero, il deossiribosio (ha solo un idrogeno legato all'atomo di carbonio in posizione 2'); 3) quattro basi azotate: adenina e guanina (purine: struttura a doppio anello), citosina e timina (pirimidine: struttura a singolo anello). Quando la base è legata al deossiribosio, diventa un deossinucleoside (deossiadenosina, deossicitidina, deossiguanosina, deossitimidina). Quando è presente anche un gruppo fosfato si ha il deossinucleoside monofosfato (=nucleotide).

Regole di Chargaff: regole che riguardano la quantità di ogni tipo di nucleotide contenuto nel DNA → 1) la quantità totale di nucleotidi pirimidinici (T + C) è sempre uguale alla quantità totale di nucleotidi purinici (A + G); 2) la quantità di T è sempre uguale alla quantità di A e la quantità di C è sempre uguale alla quantità di G; però, la quantità di A + T non è necessariamente uguale a quella di C + G.

Diffrazione a raggi X (Rosalind Franklin): i raggi X vengono sparati su fibre di DNA e la loro diffrazione è rilevata impressionando una pellicola fotografica.