Riassunto esame Citologia e istologia, Prof. Migliaccio Vincenzo, libro consigliato Citologia e Istologia, Isabella dalle Donne

12 cos’è che un tessuto?

È un insieme di cellule differenziate che svolgono una determinata funzione nell’organismo.

Cellule => tessuti => organi => sistemi integrati

Preparazione di un campione istologico

Osservazione al microscopio ottico in luce visibile:

1. Prelievo del campione
2. Processamento:
   • Lavaggio in NaCl 0.9% (soluzione fisiologica)
   • Fissaggio attraverso opportuni fissativi (il fissaggio fa permanere il tessuto nella situazione in cui l’abbiamo prelevato)

Il fissaggio avviene attraverso specifici fissativi:

• Paraformaldeide
• Carnoy
• Bouin
• Histoclear
• Formolo calcico

3. Disidratazione
4. Diafanizzazione
5. Inclusione

Cos’è che la fissazione?

La fissazione è il trattamento dei tessuti con agenti chimici che permette di bloccare l’autolisi cellulare, preservando nel tempo la morfologia originaria del tessuto in studio. La fissazione può essere sia chimica che fisica.

Fissazione chimica: ha una durata di 12-24h e prevede l’uso di agenti stabilizzati che immobilizzano il materiale macromolecolare tramite la formazione di legami trasversali (cross-link) tra catene proteiche adiacenti in modo da bloccarle nella loro posizione.

Per facilitare la penetrazione del fissativo, il tessuto deve essere ridotto in piccoli frammenti.

Tra i fissativi chimici distinguiamo:

• Fissativi che coagulano le proteine: etanolo, acido acetico, acido picrico, etc…
• Fissativi che non coagulano le proteine: formalina neutra tamponata, liquido di Bouin, tetrossido di osmio, bicromato di potassio.

La fissazione può avvenire per immersione o per perfusione. La fissazione per immersione è il metodo più usato, ma la fissazione per perfusione è il metodo più efficace poiché permette di fissare organi più voluminosi, ma è limitata ad animali di piccola taglia. La perfusione è raccomandabile per lo studio di organi facilmente deteriorabili come l’encefalo.

La perfusione consiste nel veicolare il fissativo attraverso il sistema circolatorio dell’organismo.

La fissazione fisica si opera mediante il congelamento in azoto liquido (-170°). Il congelamento permette di mantenere nei tessuti i depositi di lipidi, altrimenti persi durante il processamento.

Disidratazione

Bisogna disidratare perché l’acqua è nemica della paraffina, quindi senza disidratazione il campione non può essere incluso in paraffina. Deve essere un processo graduale per non far raggrinzire le cellule.

Per disidratare si usa etanolo a gradazione crescente:

• Etanolo 70% (permette al tessuto di rimanere nelle stesse condizioni anche per anni)
• Etanolo 75% (favorisce la disidratazione)
• Etanolo 95% (24h per far uscire tutta l’acqua)
• Etanolo 100% (3 passaggi da 1h l’uno).

Diafanizzazione

Un tessuto deve andare incontro a diafanizzazione affinché si verifichi una corretta penetrazione nella paraffina e, soprattutto, allontana le impurità.

In xilene puro. Prima si usava il benzene o il toluene, ma si è scoperto che sono cancerogeni.

Si fanno 3 passaggi da 15 minuti in xilene puro e serve a sciogliere i lipidi (anche le membrane).

Il tempo affinché un tessuto diventi diafano dipende da:

• Purezza della soluzione diafanizzante;
• Dimensioni del campione;
• Disidratazione;

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Inclusione

Abbiamo bisogno di un mezzo di inclusione che, dopo la solidificazione, fornisca supporto meccanico durante il sezionamento. Per la microscopia ottica si usa come mezzo di inclusione la paraffina (una miscela di idrocarburi che solidifica a temperatura ambiente).

Il campione viene immerso in paraffina fusa e viene lasciato solidificare a temperatura ambiente.

Taglio

Il campione ha ora la consistenza adatta per essere tagliato al microtomo. Il microtomo è uno strumento dotato di una lamina e di un braccio su cui viene fissato il blocchetto di paraffina contenente il campione e che permette di ottenere sezioni sottili che vanno dai 5 ai 10 micrometri. Se il processamento non è avvenuto correttamente, il tessuto, dopo l’affettatura al microtomo, presenta dei tagli.

Affinché nel campione non ci siano grinze, si passa il vetrino in acqua a temperatura inferiore a quella di fusione della paraffina (circa a 40°), in tal modo si distende la paraffina e anche il tessuto.

Nella microscopia elettronica l’inclusione avviene in epon e si taglia con la punta di diamante. In Oil Red, invece, si affetta al criostato, senza l’inclusione in paraffina, ma si include in paraformaldeide.

Colorazione

Per colorare un tessuto dobbiamo allontanare la paraffina con lo xilene e poi dobbiamo idratare il tessuto in etanolo decrescente.

Emallume-eosina

È una colorazione bicromica che colora i nuclei di blu violaceo e il citoplasma di rosa. Ciò è dovuto al fatto che l’emallume (che dà la tipica colorazione bluastra) si lega agli acidi nucleici, mentre l’eosina è affine agli amminoacidi basici (lisina, arginina e histidina) e li colora di rosa intenso.

Passaggi:

• Colorazione del nucleo in emallume;
• Passaggio in acqua distillata per rimuovere l’emallume in eccesso (pH=6);
• Viraggio del colore in acqua di fonte (pH=8);
• Passaggio in eosina che colora il citosol;
• Passaggio in acqua distillata per togliere l’eccesso di eosina;
• Disidratazione con l’etanolo a concentrazione crescente, affinché il tessuto si conservi nel tempo;
• Passaggio in xilene puro per chiarificare il tessuto;
• Copertura con resina montante e vetrino copri oggetto.

N.B. Se l’eosina è molto carica (di solito si utilizza eosina allo 0.5%), colora il tessuto in modo molto intenso e non si riescono a distinguere le strutture cellulari in maniera ottimale.

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Organi cavi e organi pieni

Gli organi cavi sono viscerali o vascolari. Sono caratterizzati da un lume e da una parete (es: stomaco, intestino, vasi sanguigni).

Le cellule della parete sono caratterizzate da un epitelio che appoggia su un connettivo.

Gli organi cavi sono caratterizzati da un tessuto epiteliale che poggia sul tessuto connettivo. Il tessuto connettivo può contenere anche tessuto muscolare liscio (che nelle arterie serve a pompare sangue verso la periferia).

Gli organi pieni hanno un parenchima cellulare molto organizzato (organi parenchimatosi). Es: fegato, reni.

Si definisce parenchima la parte di organo pieno delimitata da stroma fibroso e vascolare costituito da epitelio che si dispone sotto forma di cordoni (es: fegato), tubuli (es: ghiandole esocrine) e acini (es: pancreas).

Le cellule del parenchima si organizzano su una rete connettivale.

Gli organi sono rivestiti da una capsula fatta da un connettivo denso, che si introflette nell’organo e si ramifica; da tale ramificazione si forma lo stroma, che divide l’organo in sezioni più grandi e via via più piccole.

In alcuni organi capsula e stroma contengono oltre a fibre di collagene anche fibre elastiche e cellule muscolari lisce (es: prostata).

La capsula si introflette nell’organo formando prima sei setti (spessi), i quali si assottigliano in profondità formando un reticolo (impalcatura).

L’insieme di setti e reticoli costituisce lo stroma dell’organo, fatto da connettivo fibroso.

Lo stroma suddivide gli organi pieni in lobuli (territori indipendenti nell’irrorazione sanguigna e linfatica, l’innervazione e il drenaggio).

Lo stroma oltre a sostenere e suddividere l’organo funge anche da guida per vasi e nervi (ilo). Man mano che si ramifica lo stroma lo fanno anche i capillari.

N.B. Gli epiteli non contengono vasi sanguigni, ma prendono ossigeno e nutrienti dal sottostante tessuto connettivo, il quale ha quindi una funzione di supporto ma anche una funzione trofica.

Anche il muscolo scheletrico è un organo pieno. All’interno è suddiviso in strutture sempre più piccole, fino ad arrivare alla fibrocellula muscolare.

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La parte esterna che ricopre il muscolo si chiama epimisio, ogni fascio muscolare è circondato da perimisio, le fibre muscolari sono circondate dall’endomisio.

L’endomisio svolge funzione trofica, meccanica e nervosa.

Non si parla di cellula muscolare ma di fibra muscolare perché la singola cellula muscolare striata non vive di funzione propria ma è fusa citoplasmicamente con altre cellule.

I nuclei di queste cellule sono disposti alla periferia e al centro c’è il citoplasma con le proteine contrattili che formano i sarcomeri che servono alla contrazione.

Il nucleo dei sincizi è spostato alla periferia perché il citoplasma occupa tutto lo spazio a disposizione. Tra le fibre ci sono i mitocondri che devono produrre l’ATP.

Ci sono dei mitocondri sotto la membrana plasmatica, chiamati subsarcolemmatici, tra le fibre ci sono i mitocondri intermiofibrillari.

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Fegato colorato in emallume-eosina

I lobuli tipicamente hanno forma esagonale ed esternamente troviamo la porzione di connettivo che si è invaginata dalla capsula epatica e che quindi ha suddiviso il fegato in lobuli.

Ogni organo al centro ha una vena (vena centro-lobulare).

Gli spazi bianchi sono le parti dello stroma che si è invaginato e ha permesso la formazione dei lobuli.

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Patologie epatiche al M.O.

Nei soggetti molto grassi o in quelli che bevono molto alcol si va incontro a steatosi epatica: gli epatociti presentano delle porzioni bianche che sono le porzioni di grasso che si depositano all’interno. Quando si infiamma il fegato si formano delle cellule di forma sferica (balloning shape degli epatociti), in cui si perde l’organizzazione strutturale tipica del fegato e non si distinguono più i cordoni e abbiamo una ipofunzionalità dell’organo.

Alterazioni del fegato con alterazioni in colorazione Oil Red

Oil Red staining

L’affettatura deve avvenire al criostato in quanto non possiamo includere il tessuto in paraffina. Se lo facessimo, elimineremmo tutti i lipidi durante la diafanizzazione. L’Oil Red colora i lipidi di rosso.

Per i tessuti:

• Affettatura al criostato, il tessuto è mantenuto a -35°C
• Fissaggio: 10 minuti in paraformaldeide
• Immersione del vetrino in una soluzione di isopropanolo 60%
• Colorazione con isopropanolo 60%
• Risciacquo con acqua distillata
• Montaggio con vetrino coprioggetto

Per le cellule:

• Cellule adese sul vetrino
• Fissaggio: del vetrino in una soluzione di isopropanolo 60%
• Immersione del vetrino in una soluzione di isopropanolo 60%
• Colorazione con isopropanolo 60%
• Risciacquo con acqua distillata
• Montaggio con vetrino coprioggetto

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È necessario l’isopropanolo in quanto l’Oil Red in acqua non si scioglierebbe e quindi sciogliamo il colorante direttamente in isopropanolo.

Tricromica di Azan-Mallory

Si usa una miscela di coloranti. La Azan-Mallory colora di blu il tessuto connettivo con le fibre collagene. Il citoplasma si colora di arancio/rosa. I nuclei sono colorati di rosso intenso.

Nella sezione a lato si osserva una sezione di fegato colorata con Azan-Mallory. Abbiamo la vena centro-lobulare. Esternamente ci sono le triadi portali e nel connettivo di un organo pieno decorrono rami delle arterie e della vena porta. Il resto è il parenchima epatico e quindi gli epatociti.

A destra c’è una sezione ingrandita di fegato colorata con Azan-Mallory.

I nuclei si colorano di rosso intenso grazie alla fuxina acida (la quale riconosce gli acidi nucleici legati agli istoni). È un fegato nutrito con un’alimentazione ricca di grassi, in quanto sono visibili molti lipidi negli epatociti.

La Azan-Mallory si basa sull’uso di tre soluzioni:

• Soluzione A: fucsina acida 1g (colora i nuclei delle cellule), acqua distillata 100ml
• Soluzione B: phosphomolybdic acido 1g, acqua distillata 100ml
• Soluzione C: orange G 2g (citoplasma di rosa), methyl blue 0.5g (colora il collagene), acido oxalico 2g (mordenzante), acqua distillata 100ml

Passaggi:

1. Sparaffinare e idratare i tessuti mediante passaggi in etanolo decrescente
2. Passaggio in soluzione A per 2 min
3. Sciacquo in acqua distillata per 1 minuto
4. Passaggio in soluzione B per 2 minuti
5. Sciacquo in acqua distillata per 1 minuto
6. Passaggio in soluzione C per 15 minuti
7. Sciacquo in acqua distillata per 1 minuto
8. Disidratazione in etanolo crescente
9. Chiarificazione in xilene
10. Montaggio con vetrino coprioggetto

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Organi cavi viscerali

Esternamente la parete è rivestita dalla tonaca. All’interno c’è il lume.

L’epitelio non è vascolarizzato, ma nel connettivo che riveste l’organo decorrono vasi e nervi.

Negli organi cavi possiamo trovare il lume, a ridosso del quale possiamo trovare l’epitelio e il connettivo sottostante.

Ci sono delle ghiandole della sottomucosa oppure delle ghiandole annesse, che sono esterne alla struttura dell’organo cavo, ma hanno i loro terminali nell’organo cavo (es: pancreas).

Negli organi cavi viscerali la parete è organizzata in quattro tonache disposte concentricamente. Dal centro verso l’esterno si osservano: la tonaca mucosa, la tonaca sottomucosa, la tonaca muscolare e la tonaca sierosa (se l’organo è nella cavità celomatica) o la tonaca avventizia (se è al di fuori della cavità celomatica).

La tonaca mucosa è formata da un epitelio di rivestimento che poggia su un connettivo lasso a fasci intrecciati, detto lamina propria o tonaca propria, che, come nell’intestino, può sollevarsi, accompagnando l’epitelio sovrastante nella formazione di villi intestinali. Nella foto a lato, in bianco c’è il lume dei villi; al di sotto delle cellule epiteliali del villo c’è il tessuto connettivo con all’interno dei vasi. In viola sono colorati i nuclei dei fibroblasti (che producono collagene) contenuti nel connettivo lasso.

Ci sono delle cellule rosa che alla base hanno il nucleo, sono gli enterociti, sono caratterizzati apicalmente (nella regione che bagna il lume) dall’avere l’orletto a spazzola.

Le cellule che costituiscono l’epitelio hanno una morfologia e un grado di organizzazione correlati alla funzione svolta dallo specifico organo.

Ad esempio nell’intestino, organo deputato all’assorbimento delle sostanze nutritive, vi è un epitelio cilindrico monostratificato che nel tratto del duodeno presenta specializzazioni funzionali, dette microvilli, che formano l’orletto a spazzola per aumentare la superficie assorbente.

N.B. I villi sono caratterizzati dagli enterociti che sulla membrana apicale portano i microvilli, che sono delle estroflessioni della membrana plasmatica.

L’esofago, organo sottoposto a usura meccanica per il passaggio del cibo, ha invece un epitelio pavimentoso pluristratificato non corneificato. Negli organi cavi, gli epiteli di rivestimenti danno origine anche a ghiandole esocrine che possono avere localizzazione diversa. Quelle confinate nell’epitelio vengono dette ghiandole intraepiteliali (es: cellule caliciformi mucipare, ghiandole unicellulari che producono muco. Hanno la porzione citoplasmatica e il nucleo alla base e ci sono i granuli che contengono mucine, polimeri di glucosio e altri zuccheri semplici); quelle che si sviluppano all’esterno dell’epitelio, ma rimangono nella parete dell’organo, vengono dette ghiandole intraepiteliali (es: ghiandole gastriche dello stomaco, che si sviluppano nella lamina propria della tonaca mucosa, e ghiandole nel Brunner dell’intestino tenue, che raggiungono la tonaca sottomucosa); quelle che si sviluppano al di fuori della parete dell’organo vengono dette ghiandole extraparietali, ma queste, tramite un dotto riversano comunque nel lume dell’organo il loro secreto (es: fegato e pancreas, che riversano il loro secreto nel duodeno).

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Negli organi cavi dell’apparato digerente, la tonaca mucosa presenta cellule muscolari lisce che si organizzano al di sotto della lamina propria a formare la muscularis mucosae, per rendere indipendenti alcuni movimenti della tonaca mucosa rispetto alle restanti tonache.

La tonaca sottomucosa è formata da connettivo lasso che garantisce non solo una separazione tra la tonaca mucosa e le restanti tonache che formano la parete dell’organo, ma anche una certa mobilità, favorita anche dalla muscularis mucosae. La sottomucosa può alloggiare ghiandole esocrine, come le ghiandole del Brunner nell’intestino, ed è sede di vasi e nervi. Anche la tonaca sottomucosa può sollevarsi, come si può osservare nell’intestino, dove forma le pliche intestinali, per aumentare la superficie di assorbimento. Al di sotto si trova la tonaca muscolare formata da cellule muscolari lisce che si organizzano in due strati: nello strato interno hanno un orientamento circolare, mentre nello strato esterno hanno un orientamento longitudinale. Questa diversa disposizione favorisce due tipi di movimenti: peristolici, che permettono all’organo di modificare il proprio volume adattandosi al contenuto presente nel suo lume, e peristaltici, che permettono la progressione del contenuto nel lume dell’organo. In genere la tonaca muscolare è formata da cellule muscolari lisce, eccetto che nella faringe, nel terzo superiore dell’esofago (la parte distale a una contrazione involontaria) e negli sfinteri, dove si trovano le fibre muscolari striate.

Al di sotto della tonaca muscolare, l’organo cavo viscerale è rivestito da una tonaca sierosa o da una tonaca avventizia, la cui funzione è quella di circondare l’organo e permettergli