Riassunto esame Biologia dello sviluppo, Prof. Vignali Robert, libro consigliato Developmental Biology, Gilbert

Biologia dello sviluppo

Concetti ed eventi introduttivi

La biologia dello sviluppo si occupa dello studio dei meccanismi molecolari, cellulari e sovracellulari che regolano lo sviluppo embrionale. Nasce dall'embriologia e vi integra una serie di concetti provenienti da biologia molecolare, genetica, biologia cellulare, anatomia, neurobiologia, ecc.

L'informazione genetica necessaria per lo sviluppo di un organismo si trova nel DNA: la sequenza nucleotidica contenuta nella doppia elica viene trascritta in mRNA, che viene tradotto in proteina. Sono le proteine l'ultimo effettore dell'azione di molti geni, in quanto esplicano l'azione di dirigere lo sviluppo; alcune proteine significative sono i fattori di trascrizione, che sono in grado di ritornare sulla doppia elica del DNA, riconoscendo sequenze specifiche, per modulare l’espressione dei geni.

Storia dell'embriologia

L'embriologia è lo studio dell'embrione. Il primo embriologo è probabilmente stato Aristotele: scoperchiava le uova di pollo e si cimentava nell'osservare lo sviluppo dell'embrione del pollo. Si parla di embriologia descrittiva, poiché prendeva nota di come l’embrione cambia, di come le nuove strutture compaiono e possono essere osservate.

Successivamente, Marcello Malpighi fece osservazioni degli embrioni al microscopio. Con lui ha inizio una delle grandi dispute: preformismo vs epigenesi.

• Preformismo: gli organi dell’embrione sono già presenti, in miniatura, nell’uovo o nello spermatozoo; teoria sostenuta da Malpighi.
• Epigenesi: sviluppo progressivo che parte dallo stadio iniziale ad una cellula, in cui ogni stadio è un prerequisito per passare allo stadio successivo; teoria sostenuta da Aristotele.

Per decidere quale di queste due visioni è corretta, è necessaria l'embriologia sperimentale, che prevede di lavorare sugli embrioni sperimentalmente, introducendo variazioni nel normale sviluppo per vedere l’effetto che fa. Wilhelm Roux è stato il primo embriologo sperimentale: non si limitò più alla mera descrizione dell’embrione, ma cominciò ad intervenire nel suo sviluppo per capire quali sono i meccanismi che lo regolano.

Esperimenti storici in embriologia

Il suo fu un esperimento storico (sbagliato), che segnò la nascita di questa branca nel 1884: Roux prese un uovo fertilizzato di rana e, quando raggiunse lo stadio di due cellule (blastomeri), con un ago rovente ne uccise una. L'embrione venne fatto sviluppare e il risultato, allo stadio di neurula, fu la formazione di solo metà dell'embrione corrispondente al blastomero rimasto in vita.

La domanda era: "Questo embrione è un mosaico di pezzi, per cui se ne distruggiamo un pezzo si forma solo una parte del dipinto finale, oppure le parti dell'embrione si possono regolare, per cui se ne distruggiamo un pezzo esso può riorganizzarsi e ricostruire il tutto completo?"

Roux interpretò l'esperimento dicendo che lo sviluppo è a mosaico, ma si sbagliò: la cellula che abbiamo ucciso è morta, ma la compagna, viva, ne percepisce la presenza e forma comunque la metà che avrebbe formato normalmente.

Come si può dimostrare questa ipotesi? L’esperimento è stato ripetuto separando fisicamente i due blastomeri, invece che uccidendone uno; da ciascuna delle due cellule si sviluppò un embrione intero. Conclusione: le due cellule, se stanno insieme, ognuna si regola di conseguenza all’altra facendo solo la metà dell’embrione; se sono separate, ciascuna ha la potenzialità di formare l’embrione intero. Si tratta di sviluppo regolativo e non a mosaico.

Il primo esperimento che dimostra la capacità regolativa dei blastomeri nei primi stadi embrionali è stato effettuato sul riccio di mare da Hans Driesch nel 1892. In condizioni di sviluppo normali, dopo la segmentazione, si forma un embrione composto da tante cellule, che evolve in una larva chiamata pluteo. Quando vennero separati i due blastomeri, normalmente uno moriva, mentre l'altro era in grado di formare una blastula normale e un normale pluteo. Ciò che occorre è in grado di regolarsi e formare l'intera larva.

Se si aspetta lo stadio successivo a 4 cellule, e si riesce a separare i 4 blastomeri, vediamo che ciascuno di questi quattro è in grado di formare una larva intera; ciò indica che la capacità regolativa va oltre lo stadio di 2 cellule. Nello stadio a 8 blastomeri (4 sopra, nella parte animale, e 4 sotto, nella parte vegetativa) è diverso: se i 4 animali e i 4 vegetativi vengono separati, i primi danno una larva ricca di ectoderma (definita “animalizzata”) mentre dai 4 blastomeri vegetativi si forma una larva ricca di endoderma e mesoderma (definita “vegetalizzata”).

È evidente che i blastomeri non sono equivalenti: ci deve essere un'asimmetria nella distribuzione dei componenti importanti tra le cellule animali e quelle vegetative. La capacità regolativa non è illimitata nel tempo e nello spazio: dipende da come dividiamo le cellule e dallo stadio di sviluppo in cui facciamo questo intervento.

Esperimento di Spemann e Mangold

L'esperimento di Hans Spemann e Hilde Mangold sui tritoni (anfibi; 1924) all'inizio della gastrulazione inizia con movimenti morfogenetici che servono per costruire i tre foglietti embrionali: ectoderma (esterno), endoderma (interno) e mesoderma (nel mezzo). L'inizio della gastrulazione negli embrioni di anfibio è segnato dalla comparsa di una piccola invaginazione chiamata blastoporo; il pezzo di tessuto sopra il blastoporo è chiamato labbro dorsale del blastoporo.

Questo frammento di tessuto è stato prelevato da un embrione donatore e trapiantato sul lato ventrale di un embrione ospite, il quale si trovava allo stesso stadio di sviluppo (ha quindi il suo normale blastoporo in posizione dorsale). Sul lato ventrale dove è stato trapiantato il pezzo, iniziò una seconda invaginazione (intestino primitivo); andando avanti nello sviluppo, si formarono due larve tenute unite per il ventre, con un asse embrionale secondario.

Ciò dimostra che il pezzo trapiantato è in grado di dirigere la formazione e l'organizzazione di un asse embrionale sul lato ventrale dove normalmente l'asse embrionale non ci sarebbe. Per questo, il labbro dorsale del blastoporo è stato chiamato anche organizzatore primario (o di Spemann), perché si pensava che gli eventi induttivi promossi da esso fossero i primi eventi nello sviluppo; oggi sappiamo che in realtà ci sono eventi ancora più precoci.

Da un punto di vista biochimico e molecolare, cercarono di capire quali fossero le "sostanze" organo-formative contenute in queste cellule, tali da guidare lo sviluppo. Solo con l'avvento della biologia molecolare, quindi con la scoperta della doppia elica e con la possibilità di clonare i geni, è stato possibile scoprire quali sono i geni importanti che rendono il labbro dorsale del blastoporo così importante per la regolazione dello sviluppo embrionale.

Con la possibilità di isolare e clonare i geni si è potuto cominciare e studiare come i geni controllano lo sviluppo. Il primo organismo modello utilizzato è stato la Drosophila.

La Drosophila come modello di studio

Perché la Drosophila?

• Sviluppo rapido: in un giorno, dall'uovo si arriva allo stadio di larva percorrendo tutto il cammino dell'embriogenesi. Con uno stereomicroscopico è possibile seguire tutte le fasi dello sviluppo: una volta che si è formata la prima larva, si ha una larva di secondo e poi di terzo stadio; in pochi giorni si arriva allo stadio di pupa e quattro giorni dopo nasce l'adulto intero ciclo vitale in 10 giorni.
• Si conosceva abbastanza bene la genetica perché la Drosophila è stata abbondantemente utilizzata per capire i meccanismi dell’ereditarietà dei caratteri. Molti alleli mutanti erano stati caratterizzati e quindi era possibile controllare caratteri fenotipici immediatamente visibili. Esempio: colore degli occhi (normalmente sono rossi ma nella forma allelica recessiva white sono bianchi).
• Vi sono solo 4 cromosomi e, nelle ghiandole salivari larvali, i cromosomi sono politenici: formati da molti filamenti di cromatina che si allineano in una struttura che può essere colorata formando un bandeggio costante e riproducibile, che corrisponde a loci cromosomici sui quali si potevano costruire delle mappe del genoma molto dettagliate.

La Drosophila fu usata per un programma di screening di mutanti, ovvero di ricerca di mutanti (= individui con caratteristiche fenotipiche aberranti). Questa tecnica si basava sulla somministrazione di composti o sull’irraggiamento con raggi X di vari individui, che poi venivano incrociati per ottenere adulti, larve o embrioni mutanti che si potessero immediatamente distinguere dagli individui wild-type.

Drosophila wild-type: corpo segmentato con testa (3 segmenti), torace (3 segmenti) e addome (8 segmenti). Il primo segmento toracico (T1) porta solo un paio di zampe; gli altri due (T2 e T3) portano ciascuno un paio di zampe e poi il T2 porta un paio d'ali e il T3 un paio di ali modificate e ridotte (bilancieri).

Mutante bithorax: ha un T1 e due T2, quindi porta due paia di ali. Mutante antennapedia: al posto delle antenne, sulla testa, porta un paio di zampe.

Attraverso questo programma di screening sono stati prima caratterizzati i fenotipi mutanti e poi sono stati isolati i geni colpiti da queste mutazioni. Studiando l'espressione e l'azione di questi geni si è capito come essi regolano lo sviluppo della Drosophila.

I primi tre studiosi che hanno scoperto i segreti dello sviluppo animale usando la Drosophila come modello sono Ed Lewis, Christiane Nüsslein-Volhard, Eric Wieschaus (1995).

Altri animali modello

Vi sono anche altri animali modello (vertebrati): Zebrafish (D.rerio), X.Leavis (rana), M.musculus, G.gallus (pollo). Fra i modelli inferiori si ha Caenorhabditis elegans, nematode che ha la caratteristica particolare di avere 959 cellule somatiche fisse; se ci sono cellule in più o in meno, possiamo star certi che si tratti di un mutante. In più, la genealogia di queste cellule è completamente nota.

Differenziamento

A partire dallo zigote, con le prime divisioni, si arriva alla blastula; durante la gastrulazione vengono individuati i tre foglietti (ectoderma in celeste, endoderma in giallo, mesoderma in rosso). Da questi tre foglietti viene costruito il soma (cellule somatiche) di tutto l'individuo. Alcuni esempi:

• Ectoderma → melanociti (cellule pigmentate), sistema nervoso centrale e periferico, cellule dell’epidermide;
• Mesodema → notocorda, tessuto osseo, eritrociti, muscolo;
• Endoderma → sistema digerente e respiratorio.

Una speciale popolazione di cellule, che non fanno parte dei tre foglietti, costituisce la linea delle cellule germinali, destinate alla riproduzione.

Teoria del plasma germinale di Weismann

Come si realizza il differenziamento? Il primo che cercò di dare una spiegazione fu Weismann nel 1883 con la teoria del plasma germinale: suppose che i determinanti che indirizzano le cellule verso i vari destini differenziativi siano tutti presenti e siano mantenuti nella linea germinale, mentre suppose che nella linea somatica le singole linee cellulari mantengano solo alcuni determinanti.

Il modello proposto da Weismann vedeva i determinanti contenuti nel nucleo (sui cromosomi); essi, con le divisioni, vengono ripartiti nelle diverse linee cellulari. I determinanti elaborano delle sostanze che vengono passate nel citoplasma.

Questa teoria, così com’è configurata in questo esempio, ci suggerisce come funziona un modello dello sviluppo a mosaico. Ci dice anche che nel differenziamento alcuni determinanti vengono perduti da alcune cellule e mantenuti da altre: le cellule non hanno la totipotenza che hanno all'inizio.

Esperimento di Spemann

La dimostrazione sperimentale della teoria fu fatta da Spemann, con uova di anfibio: allo stadio di 8 cellule, l’embrione veniva strizzato con un capello in modo da impedire al nucleo del blastomero di passare sull’altro lato; dopodiché, quando l’embrione raggiungeva lo stadio di 16 cellule, si consentiva al nucleo di passare sull’altro lato e poi, stringendo del tutto il capello, si separava del tutto la singola cellula con il suo nucleo.

Se la teoria di Weismann fosse vera, non si potrebbero formare due embrioni completi. Il risultato che si ottenne fu diverso: facendo crescere i due pezzi di embrione, ciascuno forma una larva completa. Questo esperimento ci dice che almeno in questo stadio di sviluppo, tutti i nuclei contengono tutti i determinanti necessari; non vi è una riduzione precoce dei determinanti.

Esperimento di Briggs e King

Si può allora pensare che nuclei di cellule somatiche possano perdere una parte dei determinanti? Esperimento di Briggs e King su embrioni di Rana pipiens (1952) nello stadio precedente alla fecondazione, l’ovocita si trova in una fase della meiosi nella quale può essere rimosso chirurgicamente il fuso meiotico; in questo modo viene rimosso il genoma materno prima che venga ridotto dalla meiosi.

L’uovo attivato, senza i suoi cromosomi, non può fare niente; avendo tolto dei cromosomi è possibile metterne di nuovi prendendo un nucleo da cellule donatrici e iniettandolo nell’uovo attivato. L'embrione, eventualmente, si sviluppa. Se i nuclei vengono presi da embrioni abbastanza precoci (blastula), l’80% delle uova iniettate si sviluppano normalmente; ciò significa che i nuclei della blastula sono ancora totipotenti nell’80% dei casi.

Se prendiamo nuclei negli stadi successivi dell’embriogenesi, la percentuale si riduce; ciò implica che man mano che si va avanti nello sviluppo i nuclei perdono la capacità di regolare lo sviluppo. Conclusione: i nuclei perdono una certa totipotenza.

Esperimento di Gurdon

Esperimento di Gurdon (1962) su Xenopus levis ripeté l’esperimento di Briggs-King su uova del ceppo wild-type, che furono iniettate con nuclei somatici di un mutante albino (prelevati dalla membrana interdigitale posta tra le dita degli arti posteriori). Con questa procedura, alla prima generazione pochi embrioni sopravvivono.

Se da questi embrioni si prendono i nuclei e si ripete il passaggio più volte, i nuclei sono in grado di guidare lo sviluppo embrionale fino alla fase adulta. Questo dimostra che le cellule somatiche non sono in grado di dirigere completamente lo sviluppo (hanno perduto i determinanti, secondo la teoria di Weismann), ma, passandoli in embrioni, si possono riprogrammare ("ringiovanire").

Ciò funziona anche nei mammiferi, ed infatti nel 1996 una procedura simile fu adottata per creare la pecora Dolly. Partirono da due razze diverse di pecore: Scottish blackface fornisce l’oocita e Finn-Dorset è il donatore di nuclei. Cellule della ghiandola mammaria di una pecora Finn-Dorset gravida vennero messe in coltura e sincronizzate in modo che arrivassero tutte in fase G1. Dopo aver privato gli ovociti di una Scottish blackface dei propri nuclei, proseguirono con la fusione dei due citotipi, che fu ottenuta grazie all’unione delle due e alla loro esposizione a impulsi elettrici.

Queste cellule vengono prese e, una volta rimosso il fuso meiotico dall’oocita, vengono fatte fondere tramite scarica elettrica con l’uovo. Una volta ottenuti gli embrioni, essi furono trasferiti nell’utero di pecore Scottish blackface gravide; solo un ovocita sopravvisse e diede vita a Dolly. I nuclei di cellule somatiche di vertebrati adulti contengono tutti i geni necessari per originare un organismo adulto.

Cellule staminali embrionali

Oggi la nuova frontiera della biologia dello sviluppo sono le cellule staminali embrionali, ovvero le cellule pluripotenti che si ottengono dall'embrione di mammifero nello stadio di blastula (blastocisti). La blastocisti ha una forma sferica con una massa cellulare interna eccentrica; cellule di questa massa cellulare interna possono essere messe in coltura e coltivate a lungo dando vita alle cellule staminali.

Cellule staminali si possono ottenere anche da cellule germinali primordiali (pluripotenti: possono dar vita a qualsiasi tipo cellulare) o da tessuti dell’adulto (multipotenti: possono dar vita solo alle cellule del tessuto in cui si trovano). Le cellule staminali sono cellule che sono in grado di dividersi e mantenere la loro pluripotenza in presenza di un particolare fattore che si aggiunge alla coltura; quando il fattore viene tolto, le cellule differenziano e possono essere indirizzate in diverse vie differenziate utilizzando fattori di crescita ad hoc. Questo tipo di espressione di geni in vitro ricalca molto da vicino la normale espressione dei geni nei tessuti che si differenziano in vivo nell’embrione.

Ciò significa che queste cellule diventano un modello sperimentale su cui possiamo cercare di ricostruire gli step essenziali per capire il differenziamento, anche dal punto di vista biochimico-molecolare (senza bisogno di animali). Le cellule staminali possono essere utilizzate per terapie cellulari, per rimpiazzare organi o tessuti difettosi per conseguenza di un gene mutato.

Esempio: topo difettivo di un gene necessario per l'ematopoiesi. Si possono prendere cellule somatiche dalla coda e metterle in coltura; il nucleo viene poi trasferito in un oocita privato di nucleo. Allo stadio di blastocisti, le cellule della massa cellulare interna possono essere messe in coltura, e anche se sono difettive, possiamo correggerle con vettori che portano la copia corretta del gene difettivo (sostituzione del gene mutante con il wild-type). Si formano quindi delle cellule staminali embrionali che, una volta coltivate, possono essere ri-trapiantate nel topo per correggere il suo difetto.