Replicazione del DNA in procarioti ed eucarioti

Replicazione del DNA

La replicazione del DNA viene definita semiconservativa, ossia per la sintesi dei nuovi filamenti la doppia elica si apre e si utilizzano entrambi i filamenti come stampo. I filamenti di nuova sintesi sono pertanto il prodotto dell'enzima DNA polimerasi.

Tre modelli di replicazione del DNA

Il modello semiconservativo è stato confermato con il risultato di un esperimento condotto da due ricercatori: come ipotesi di partenza avevano tre possibilità e quindi si procedeva in maniera conservativa, dispersiva o semiconservativa.

L'ipotesi del modello conservativo era che la doppia elica di partenza, senza subire l'apertura dei filamenti, generasse una molecola identica a se stessa.

Nel modello semiconservativo si ipotizzava che ci fosse l'apertura della doppia elica e ogni filamento venisse usato come stampo. In prima generazione si aveva quindi una doppia elica con un filamento vecchio che funge da stampo per il nuovo. In seconda generazione ciascuna doppia elica funge da stampo e quindi, con la doppia elica con i filamenti nuovi e vecchi, produce sia una doppia elica del tutto nuova, sia una doppia elica con il vecchio filamento utilizzato come stampo.

Nel modello dispersivo, il DNA va incontro a frammentazione e poi ciascun frammento si duplica. Il risultato di questo processo è la mescolanza casuale dei frammenti che generano le doppie eliche.

Per confermare quale di queste ipotesi fosse quella giusta si è lavorato con cellule di E. Coli. Si era partiti dall'idea che il DNA per potersi replicare dovesse formare nuovi filamenti, e quindi la cellula dovesse usare le sostanze presenti sul terreno di coltura. I ricercatori hanno pertanto utilizzato gli isotopi dell'azoto N¹⁵ (pesante) e N¹⁴ (leggero), dove N¹⁵ è presente nelle doppie eliche di E. Coli, mentre N¹⁴ si trova sul terreno di coltura e verrà utilizzato come mattoncino per la formazione del nuovo filamento.

La provetta è stata poi posta ad ultracentrifugazione in un gradiente di cloruro di cesio (CsCl) e successivamente sono state messe in evidenza le bande formate dall'ultracentrifugazione. Alla generazione 0 si ha una doppia elica formata solo dall'isotopo pesante, quindi sul gradiente di CsCl si ottiene una singola banda larga. Con il modello semiconservativo, la doppia elica si apre e viene utilizzata come stampo per il nuovo. Quindi in prima generazione si ottengono doppie eliche ed il 100% delle doppie eliche ha un filamento con l'isotopo pesante ed un filamento con l'isotopo leggero.

Analizzando la banda si vede che questa è spostata di poco rispetto alla precedente, questo perché ora la doppia elica risulta più leggera per via del filamento formato dall'isotopo leggero. Questi filamenti vanno di nuovo in replicazione e utilizzano come mattoncini l'isotopo leggero, quindi in seconda generazione ci saranno doppie eliche con solo l'isotopo leggero e delle doppie eliche con un filamento leggero ed un filamento pesante. Nello spettrofotometro si osserva la formazione di due bande, in quanto le molecole si sono alleggerite per la presenza dell'isotopo leggero.

Modello del replicone

Il modello del replicone parte dall'ipotesi che la replicazione abbia inizio da un replicone, cioè l'origine di replicazione. Questi repliconi sono sequenze di DNA specifiche in cui inizia il processo di replicazione. Queste sequenze vengono riconosciute da proteine specifiche chiamate proteine iniziatrici. In questo modello del replicone gli esperimenti vengono svolti con cellule di E. Coli su terreno di coltura contenente trizio. Le cellule vengono lisate e poi vengono marcati radioattivamente i cromosomi.

Da questo esperimento è emerso che i batteri come E. Coli hanno un solo punto di replicazione chiamato OriC e che la replicazione avanza in entrambe le direzioni. Nel modello bidirezionale si ottiene un DNA a forma di lettera θ, mentre nel modello unidirezionale si forma il D-loop. Siccome nelle cellule procariotiche si ha un unico punto di origine della replicazione, la dimensione del replicone corrisponde con tutto il genoma.

Replicone negli eucarioti

Negli eucarioti non c'è una sola origine di replicazione, ma ci sono più origini, in quanto le dimensioni del genoma sono maggiori. Si parla quindi di origini di replicazioni precoci e tardive (in quanto si attivano successivamente). Man mano che si attivano le origini di replicazioni tardive, la bolla di replicazione iniziata dall'origine di replicazione precoce diventa più grande, in quanto le bolle di replicazione si fondono tra loro. Le origini di replicazione non vengono utilizzate sempre tutte durante il processo.

La forma più semplice di organismo eucariotico è il lievito Saccharomyces cerevisiae. Nel lievito abbiamo circa 350 origini di replicazione chiamate ARS e considerando che la grandezza del genoma del lievito è di circa 13,5 Mpb, dividendo questo valore per 350 si ottiene un valore di 40 kpb, corrispondente alla grandezza del replicone.

All'interno di tutte le ARS si può distinguere una zona a sequenza specifica, chiamata ACS e questa sarà la sequenza riconosciuta dalla sequenza iniziatrice. L'altra zona delle ARS è la sequenza DUE (DNA Unwinding Element) ed è una zona che non ha una determinata specificità. Questa sarà la zona in cui si aprirà la doppia elica e dove si assembla il macchinario proteico che porterà avanti il processo di replicazione, chiamato replisoma. Sia la zona ACS, sia la zona DUE, sono ricche di coppie A-T e queste sono coppie formate solo da due legami a idrogeno, quindi si possono rompere più facilmente.

Cosa determina l'accensione delle origini di replicazione?

Dipende dall'organizzazione della cromatina che si trova in quella specifica origine di replicazione. Quindi le origini di replicazione precoci si localizzano in regioni di cromatina poco condensate, mentre le origini tardive si trovano in regioni di cromatina più condensate e quindi meno accessibili per i replisomi.

DNA polimerasi

La DNA polimerasi entra a far parte del replisoma: in E. Coli ne esistono ben cinque, e la prima è stata scoperta dal ricercatore Kornberg. La DNA pol. 1 è una proteina con attività enzimatica e per le sue reazioni sono richiesti quattro deossinucleotidi trifosfato, cioè nucleotidi liberi con tutti e tre i gruppi fosfato in posizione 5’. La DNA pol. lavora agganciandosi a un filamento predisposto che si chiama filamento innesco, questo perché la DNA pol. non può unire due nucleotidi liberi ma ha bisogno di un primer.

Quindi la DNA pol. allunga questo innesco, costruendo il filamento secondo la complementarità delle basi. Da un punto di vista direzionale, tutte le DNA pol. camminano in direzione 5’-3’, quindi il filamento stampo avrà polarità opposta. Chimicamente si ha il filamento innesco con un gruppo OH in posizione 3’ in cui deve formarsi il legame fosfodiesterico. Per formare il legame fosfodiesterico si utilizza il gruppo OH come nucleofilo e quindi con un attacco nucleofilo sul fosfato in α si lega il nucleotide monofosfato, come gruppo uscente si avrà la molecola di PPᵢ. Quest’ultimo viene scisso in due molecole di Pᵢ dall’enzima pirofosfatasi inorganica e grazie alla rottura di questa molecola si ottiene energia libera necessaria per portare a compimento la reazione della DNA pol, rendendo la reazione irreversibile.

All’interno della DNA pol. ci sono due zone: il sito di inserzione per il nucleotide trifosfato entrante e il sito di post inserzione. Il nucleotide entrante quindi si posiziona nel sito di inserzione e per continuare a leggere il filamento stampo c’è lo scivolamento in avanti della DNA pol. In questo modo il nucleotide precedentemente entrato si sposta nel sito di post-inserzione e nel sito di inserzione viene accolto il nuovo nucleotide entrante.

All’interno della DNA pol. si trovano due ioni magnesio (Mn²⁺), importanti per il processo chimico. Uno ione magnesio deprotona il gruppo 3’-OH del filamento innesco, in questo modo si forma un nucleofilo più forte. Il secondo ione magnesio viene portato con il nucleotide trifosfato in entrata e questo ione favorisce l’uscita del PPᵢ. Questi ioni Mn²⁺ sono coordinati da amminoacidi presenti nel sito catalitico della DNA pol. ma questi amminoacidi non vengono coinvolti nei processi di replicazione.

Le cinque DNA polimerasi di E. Coli

In E. Coli ci sono cinque DNA pol. e di tutte e cinque solo due sono coinvolte a livello di funzione nel processo di replicazione del DNA, mentre le altre intervengono in altri tipi di processi, come ad esempio nella riparazione dei siti lesionati. Le DNA pol. che si occupano della replicazione del DNA sono DNA pol. 1 e DNA pol. 3. La DNA pol. 3 è più complessa della DNA pol. 1, in quanto ci sono ben tre subunità, a differenza della 1 che ha una sola subunità. A livello di funzione, quella più importante è la 3, in quanto si occupa della replicazione del DNA, mentre la 1 ha una funzione più marginale, ovvero quella di processare i frammenti di Okazaki.

Le pol. possono avere altre attività aggiuntive, chiamate esonucleasiche, cioè la pol. può sia sintetizzare il filamento di nuova sintesi e inoltre possiede un sito catalitico differente con attività esonucleasica. Le nucleasi sono degli enzimi che tagliano il legame fosfodiesterico, quindi rimuovono i vari nucleotidi: il prefisso eso significa che parte da un’estremità libera e procede nell’operazione di degradazione. Esistono due tipi di attività esonucleasica: 5’-3’ e 3’-5’. L’esonucleasi 3’-5’ si sposta nella direzione opposta rispetto al cammino della DNA pol., mentre l’esonucleasi 5’-3’ procede nella stessa direzione della DNA pol. La DNA pol. 1 ha un’attività nucleasica sia 3’-5’ che 5’-3’ quindi ha altri due siti catalitici aggiuntivi. L’attività esonucleasica 5’-3’ è presente solo nella DNA pol. 1.