Regolazione dell’espressione genica - Appunti completi e schematici

Regolazione dell’espressione genica

La regolazione genica detta anche regolazione dell’espressione genica fa sì che i prodotti genici siano espressi in quantità e tempi appropriati a seconda delle necessità della cellula.

La regolazione dell’espressione genica ci mostra come su una base comune a tutte le cellule si crea la diversità da un punto di vista biologico.

Tipologie di geni

1. Geni Housekeeping: esprimono proteine coinvolte nelle funzioni cellulari di base e vitali in tutti i tipi di cellule e in diverse condizioni fisiologiche.
2. Geni Regolati: sono chiamati regolati perché soggetti alla regolazione dell’espressione genica. Sono espressi in risposta a specifici segnali o stimoli ambientali.

Regolazione genica procarioti

La regolazione dei procarioti avviene essenzialmente a livello della trascrizione, più in particolare a livello dell’operone.

Operone

L’operone è quindi il sistema di regolazione dell’espressione genica nei procarioti.

I procarioti hanno mRNA policistronici: da un singolo mRNA possono essere sintetizzati più polipeptidi diversi.

Questa caratteristica aiuta la cellula che, in risposta ad un determinato ambiente, riesce a coordinare l'espressione di più geni perché li ha sullo stesso trascritto.

Processo di attenuazione

Nei procarioti, anche se il livello di regolazione dell’operone è il principale, esiste un livello di regolazione trascrizionale che si sovrappone a quello dell’operone e che consiste nei processi di attenuazione.

L'attenuazione è un meccanismo regolatorio dell'espressione genica nei procarioti che si verifica contemporaneamente alla trascrizione dell'mRNA.

Questo processo regola l'espressione dei geni in risposta alla disponibilità di specifici nutrienti, come gli amminoacidi, e influenza la quantità di proteine che vengono sintetizzate.

Nei procarioti trascrizione e traduzione avvengono insieme, quindi mentre l’RNA polimerasi opera, il trascritto viene tradotto: l’attenuazione è una regolazione trascrizionale operata dai ribosomi. Quindi è il processo di traduzione che regola la trascrizione, questo è possibile perché nei procarioti non c’è la separazione nucleo-citoplasma.

L’operone viene trascritto e si produce un mRNA che nella sua porzione 5’, quindi la parte che viene trascritta immediatamente, presenta una corta sequenza codificante costituita da soli 13 aa (ORF = open reading frame), di questi 13 aa 2 sono di triptofano.

Questa sequenza presenta anche 4 regioni omologhe tra loro che si possono appaiare e possono formare strutture a forcina:

1. La sequenza 1 si appaia con la sequenza 2 e crea una forcina;
2. La sequenza 3 si appaia con la sequenza 4 e forma una seconda forcina;
3. La sequenza 2 si può appaiare anche con la sequenza 3.

Succede che l’RNA polimerasi trascrive, il trascritto fuoriesce dall’RNA polimerasi e il ribosoma si lega e comincia la traduzione.

Se la sintesi proteica non è presente il ribosoma non si lega, quindi l’appaiamento si ha tra la forcina 1 e la forcina 2 e tra la forcina 3 e la forcina 4 e ne segue che l’operone è spento.

1. Livelli triptofano alti: se la concentrazione di triptofano è molto alta il ribosoma si lega e comincia a tradurre la sequenza leader ORF, quindi aggiunge tutti gli aminoacidi compresi i 2 aa triptofano. Questo permette alla regione 1 di appaiarsi con la regione 2, formando una struttura a forcina detta terminatore: destabilizza l’RNA polimerasi e blocca la trascrizione.
2. Livelli triptofano bassi: se invece la concentrazione di triptofano è bassa, il ribosoma si lega sul trascritto e comincia la sintesi di questa breve proteina ORF. Tuttavia gli servono 2 triptofano e dato che la cellula ne ha pochi, succede che il ribosoma si ferma in corrispondenza di questi due codoni per il triptofano aspettando di riceverlo. Lo stallo in quella posizione, che coincide con la sequenza 1, fa sì che il ribosoma nasconda la sequenza 1. Succede quindi che la sequenza 2 può appaiarsi alla sequenza 3, la formazione della forcina 2-3 non destabilizza l’RNA polimerasi che può continuare a trascrivere tutti i geni strutturali dell’operone.

In altre parole: l’attenuazione dipende da quanto “corre” il ribosoma.

1. Livelli triptofano alti: il ribosoma va veloce perché aggiunge velocemente i 2 aa di triptofano e questo causa la formazione di una forcina che causa la fine della sintesi di mRNA.
2. Livelli triptofano bassi: quando il ribosoma arriva ai codoni triptofano, che coincidono con la sequenza 1, non può aggiungere i 2 aa triptofano perché mancano a livello cellulare e lo stallo del ribosoma sulla sequenza 1 non inibisce la trascrizione.

Regolazione genica eucarioti

La regolazione dell’espressione genica negli eucarioti non avviene solo per risparmiare energia ma è necessaria per permettere alle cellule di compiere il loro ruolo peculiare.

Quindi un neurone esprime i geni dei neuroni e non quelli del fegato e viceversa.

Sappiamo che è stato dimostrato da diversi esperimenti che all’interno di ogni cellula è presente l’informazione per definire l’organismo.

Esperimenti

Diversi esperimenti hanno dimostrato che in ogni cellula è presente l’informazione per definire l’intero organismo.

1. Primo esperimento: i primi esperimenti sono stati fatti sulle cellule vegetali. Sono state isolate cellule somatiche di carota e sono state fatte proliferare in cultura: si è visto che ognuna di queste poteva creare un organismo completo e funzionante.
2. Secondo esperimento: si è poi presa una cellula uovo non fecondata di una rana ed è stata enucleata e il nucleo è stato sostituito da un nucleo prelevato da una cellula somatica. Il composto è stato sottoposto a stimolazione ormonale e si è rigenerato l’organismo intero.

Il secondo tipo di esperimento fu utile per capire che l’informazione genetica in realtà non è contenuta nel citoplasma ma nel nucleo.

Nel primo esperimento non era possibile saperlo perché avevamo utilizzato cellule intere.

Queste tipologie di esperimenti furono utili a introdurre il processo di clonazione di un organismo vertebrato.

Clonazione

Una cellula uovo enucleata di una pecora di razza A è stata fusa con una cellula somatica, ghiandola mammaria, proveniente da una pecora di razza B: è stata fatta quindi la fusione tra la cellula uovo priva di nucleo e la cellula di ghiandola mammaria, e si è visto che la progenie era concorde con il nucleo della razza B e non con l’organismo di razza A.

Differenze tra regolazione procariotica ed eucariotica

Perché c’è tanta differenza tra i processi regolativi che sono alla base del sistema procariotico e quelli che definiscono le cellule eucariotiche?

C’è tanta differenza tra i processi regolativi dei procarioti e quelli che definiscono le cellule eucariotiche innanzitutto per la dimensione e la complessità del genoma.

Il genoma eucariotico ha un'organizzazione strutturale molto forte che la cellula procariotica ricorda solamente: il genoma procariotico ha delle proteine simil-istoniche che compattano il DNA procariotico, ma non c’è certamente il compattamento della cromatina che abbiamo visto essere tipico delle cellule eucariotiche.

Per consentire la specializzazione cellulare verranno espressi geni differenti e la regolazione avviene a più livelli:

1. Genomico;
2. Della compattazione della cromatina;
3. Trascrizionale;
4. Post-trascrizionale;
5. Traduzionale;
6. Post-traduzionale.

Regolazione genica a livello genomico

Abbiamo detto che ogni cellula dell’organismo ha in sé lo stesso patrimonio genetico.

Tuttavia in biologia, fatta la regola, trovata l’eccezione.

Un’eccezione ampiamente studiata è quella dei linfociti B.

I vertebrati producono milioni di differenti tipi di anticorpi: ognuno capace di riconoscere e legare in maniera specifica una differente molecola estranea.

Questa grande diversità anticorpale crea un problema: se ogni molecola di anticorpo fosse codificata da un gene differente, l’intero genoma umano sarebbe occupato da milioni di geni atti solo ad esprimere gli anticorpi.

I linfociti B superano questo ostacolo utilizzando un numero relativamente piccolo di segmenti di DNA che vengono riarrangiati in varie combinazioni per produrre milioni di geni per gli anticorpi. Gli anticorpi sono strutture quaternarie fatte da 2 catene leggere e 2 catene pesanti, entrambe sono definite da moduli funzionali, sequenze di DNA, che sui cromosomi hanno nomi differenti.

Questo processo coinvolge 4 tipi di sequenze di DNA:

• Modulo V: codifica per le regioni varianti, esistono 200 varianti;
• Modulo D: codifica per le regioni varianti, esistono 20 varianti;
• Modulo J: codifica per le regioni varianti, esistono 6 varianti;
• Modulo C: codifica per la sequenza costante delle catene pesanti e leggere.

Per comprendere come funziona il sistema, consideriamo le catene pesanti degli anticorpi.

Le catene pesanti sono formate da un segmento V, uno D ed uno J. Sapendo quante varianti abbiamo, è possibile produrre 200 x 20 x 6 = 24000 differenti tipi di regioni variabili della catena pesante.

Regolazione genica a livello della cromatina

Il DNA per essere trascritto deve essere raggiungibile dall'apparato trascrizionale.

La domanda che ci dobbiamo porre è la seguente: è vero che laddove un gene è espresso l’RNA polimerasi può vedere il DNA più facilmente rispetto ad una cellula che quel gene lo ha spento e quindi non accessibile all’RNA polimerasi?

In altre parole, è quindi vero che un gene spento è un gene eterocromatico e un gene acceso è un gene eucromatico?

Per rispondere a questa domanda è stato studiato il gene della globina: un gene espresso negli eritrociti.

Spiegazione propedeutica sugli enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono delle endonucleasi: degli enzimi che riconoscono delle sequenze precise e tagliano il DNA tutte le volte che trovano quella sequenza.

BAMH1 è uno di questi enzimi che riconosce la sua sequenza GAATTC e tutte le volte che vede questa sequenza la taglia.

Il gene della globina che è espresso nei globuli rossi presenta 2 siti di restrizione per BAMH1 che distano l’uno dall’altro 4,6 kb.

Se prendiamo il DNA di una qualsiasi nostra cellula e taglio con BAMH1 e vado a cercare il gene per la globina avrò un frammento di 4,6 kb.

Come faccio a trovare il gene della globina?

Per trovare questo gene nell’intero genoma:

1. Poniamo il DNA tagliato sul gel, elettroforesi su gel: ora il DNA si separa sulla base delle dimensioni dei frammenti;
2. Successivamente mettiamo sul gel un filtro e trasferiamo il DNA su questo filtro;
3. Ora prendiamo una sonda complementare al gene per la globina che si andrà ad attaccare proprio al gene stesso ovvero all’altezza 4,6 kb.

Trattamento con DNAasi e BAMH1

Adesso prendiamo una cellula di globulo rosso in fase di differenziamento e una cellula che non è differenziata: usiamo BAMH1 e DNAasi, enzimi che tagliano il DNA ma in modo aspecifico perché non riconoscono una sequenza, su entrambe le cellule.

Questo trattamento serve a capire se è possibile riscontrare il frammento da 4,6 kb su una cellula di eritrocita non differenziata. In altre parole, il trattamento serve a capire se è possibile individuare una specifica sequenza in un genoma composto di eterocromatina e dunque poter rispondere alla domanda iniziale.

1. Su cellula non differenziata: riscontriamo la presenza del frammento di 4,6 kb. Lo troviamo perché il DNA non è accessibile e quindi non può essere tagliato;
2. Su cellula differenziata: non riscontriamo la presenza del frammento 4,6 kb. Non lo troviamo perché il DNA è accessibile e dunque esposto agli enzimi di restrizione che via via determinano la scomparsa progressiva del frammento da 4,6 kb.

Questa è la dimostrazione che laddove la cromatina è decondensata, eucromatina, proprio come il DNA è accessibile alla DNAasi è anche accessibile per l’apparato trascrizionale e dunque i geni saranno espressi.

Mentre laddove la cromatina è compattata, eterocromatina, proprio come il DNA non è accessibile alla DNAasi, non è neanche accessibile per l’apparato trascrizionale e dunque i geni non saranno espressi.

Regolazione genica a livello trascrizionale

Promotore e fattori di trascrizione

Chi controlla la trascrizione dei geni eucariotici è il promotore, definito come promotore basale. Il promotore basale serve per reclutare i fattori generali della trascrizione i quali a loro volta definiscono se e quando un gene viene trascritto.

Tuttavia i fattori generali di trascrizione per avere un effetto modulatorio devono essere rinforzati da sequenze enhancer, silencer e insulator.

Oltre però a quest’ultimi, perché la trascrizione avvenga, sono necessari altri tipi di proteine chiamati coattivatori, corepressori e proteine mediatore.

Fattori specifici di trascrizione

I fattori specifici di trascrizione sono tutte quelle proteine capaci di legare il DNA e che, oltre al sito di legame per il DNA, presentano un dominio di attivazione. Il dominio di attivazione ha la capacità di interagire con altre proteine capaci di modulare l’attività dell’RNA polimerasi II.

In altre parole i fattori specifici di trascrizione:

1. Si legano a determinate sequenze di DNA;
2. Si portano dietro un dominio proteico capace di interagire con altre proteine.

Esempio: le deacetilasi, enzimi che rimuovono il gruppo acetile, non sono capaci di legare il DNA da sole ma devono essere portate da fattori di trascrizione.

I fattori specifici di trascrizione hanno 2 caratteristiche:

1. Operano in maniera modulare: lo stesso fattore di trascrizione può modulare anche geni diversi in modi diversi. Quindi, non basterà l’osservazione di un solo fattore specifico di trascrizione per determinare se un dato gene sia acceso o spento, ma devo sempre vedere con quali altri fattori si accompagna.
2. Operano in maniera cooperativa: i fattori di trascrizione si aiutano tra di loro, ad esempio, nel caso in cui vi sia un fattore di trascrizione che sta regolando l’espressione di un gene, la presenza di questo fa sì che sia facilitata l’attività di altri fattori di trascrizione nel regolare quello stesso gene.

Elementi responsivi

Gli elementi responsivi in biologia sono sequenze specifiche nel DNA che rispondono ai fattori di trascrizione.

Gli elementi responsivi permettono l’espressione coordinata di geni fisicamente lontani: la presenza dello stesso elemento responsivo in geni diversi ne permette