Proteine e DNA

Proteine

Le proteine sono macromolecole biologiche costituite da una catena di amminoacidi, legati uno all'altro tramite legame peptidico. Sono fondamentali per ogni organismo vivente in quanto possono svolgere una vasta gamma di funzioni:

• Componenti strutturali (collagene, tessuto connettivo, citoscheletro, pelle)
• Trasportatori (emoglobina)
• Trasmettitori di messaggi (ormoni peptidici)
• Catalizzatori di reazioni chimiche (enzimi)
• Difensiva (immunoglobuline)
• Controllo e regolazione dell'espressione genica
• Deposito di materiale (ferritina)

Per svolgere tutti questi molteplici ruoli, presentano strutture piuttosto diverse le une dalle altre. Si ricorda infatti la presenza di una forte correlazione fra questi due aspetti; non a caso, a una determinata struttura corrisponde una specifica funzione.

Amminoacidi

Le proteine sono eteropolimeri, catene non ramificate di monomeri amminoacidi, la cui sequenza lineare determina la forma, struttura tridimensionale o conformazione dei polipeptidi, che a sua volta ne determinerà la funzionalità. In natura si trovano 20 amminoacidi differenti, che presentano lo stesso scheletro di base, costituito da un C centrale, legato a un gruppo carbossilico, un gruppo amminico, un atomo di H e a una catena laterale o gruppo R, diversa per ogni amminoacido.

In base alle caratteristiche chimico-fisiche dei gruppi R, possono essere divisi in più gruppi:

• Idrofili o basici:
  • Ariginina
  • Lisina
  • Istidina
• Acidi:
  • Acido aspartico
  • Acido glutammico
• Polari neutri:
  • Serina
  • Treonina
  • Asparagina
  • Glutammina
• Idrofobici o apolari:
  • Alanina
  • Valina
  • Isoleucina
  • Leucina
  • Metionina
  • Fenilalanina
  • Tirosina
  • Triptofano
• Speciali:
  • Glicina, non chirale, perché il gruppo R coincide con un atomo di idrogeno
  • Cisteina, la cui catena laterale R contiene un gruppo tiolico (-SH), che le consente di creare ponti disolfuro (-S-S-) con altre cisteine
  • Prolina, per la particolare struttura del gruppo R ad anello

Legame peptidico

Il legame peptidico si forma dalla condensazione tra il gruppo carbossilico e il gruppo amminico dell'amminoacido successivo. Nella catena che si viene a formare vi saranno due estremità:

• Una estremità N-terminale, convenzionalmente a sinistra
• Una estremità C-terminale, convenzionalmente a destra

Questo è importante per accordarsi sull'ordine di lettura della catena, infatti catene composte dagli stessi amminoacidi, ma in sequenze diverse, formano proteine diverse. Il legame peptidico è un legame covalente forte, che presenta un'energia di legame di circa 100 kcal/mol. Per romperlo saranno necessari gli enzimi proteolitici, detti proteasi, studiati dalla natura proprio per espletare questa funzione. Una proteina portata ad ebollizione, infatti, verrebbe denaturata, perdendo la sua conformazione, ma senza rompere i suoi legami.

Peptidi e polipeptidi

Classificando in base alla lunghezza della catena si ottiene:

• Peptide o oligopeptide, fino a 20 amminoacidi
• Polipeptide, tra i 20 e i 60 amminoacidi
• Proteina, da 60 amminoacidi in poi, pur essendoci proteine funzionanti più corte

I peptidi possono derivare da:

• Sintesi in vitro, in laboratorio
• Scissione di una proteina di maggiori dimensioni
• Presenti in natura

Questi ultimi si definiscono peptidi naturali. I peptidi naturali si possono trovare nelle cellule eucariotiche e in tutti i loro tessuti, sia animali che vegetali. Hanno attività biologica importante, ad esempio antibiotici, tossine, ormoni e fattori di crescita. I polipeptidi hanno una lunghezza variabile, da 5 a 1000 kDa. Comunemente si tende a confondere l'accezione di polipeptide con quella di proteina:

• Per polipeptide si intende la catena prodotta dall'unione di più amminoacidi
• Il termine proteina invece è idoneo soltanto quando il polipeptide ha raggiunto la sua conformazione funzionale e il sito dove esplica la sua funzione

La differenza fra queste due accezioni dunque dipende dalla struttura, dalla funzione e dal posizionamento della sequenza di amminoacidi, non tanto dalla lunghezza della catena.

Struttura

Esistono quattro livelli diversi di conformazione strutturale per ogni proteina, i quali in modo sequenziale formano la proteina funzionante:

1. Struttura primaria: sequenza di amminoacidi all'interno del polipeptide, descritta dall'N-terminale verso il C-terminale.
2. Struttura secondaria: conformazione locale, che non impegna tutto il polipeptide, ma solo alcune regioni. È determinata da interazioni deboli, specie legami a idrogeno, formatisi fra l'ossigeno di un gruppo carbossilico e l'idrogeno del gruppo amminico di un altro legame peptidico. A seconda della periodicità con cui avvengono queste interazioni si avranno strutture secondarie differenti le une dalle altre. Le principali sono α-elica e foglietto β. Le strutture secondarie sono alla base dei motivi proteici (es. Coiled Coil Motif, Helix-Loop-Helix Motif e Zinc-Finger Motif).
3. Struttura terziaria: organizzazione spaziale completa, non soltanto di determinate regioni.
4. Struttura quaternaria: associazione di due o più polipeptidi, per comporre una proteina multimerica.

Un dominio strutturale è un'entità discreta di struttura terziaria, che spesso contiene regioni ad α-elica e a β-foglietto, in genere costituito da 50-350 amminoacidi. Si può ripetere, è stabile ed è associato a una funzione specifica (regione strutturale-funzionale). Proteine con funzioni comuni hanno generalmente domini comuni e proteine con funzioni multiple hanno generalmente un dominio diverso per ciascuna funzione. Non sono da confondere con strutture semplici super-secondarie, bensì sono strutture più complesse. Una proteina semplice può essere composta da un solo dominio, che si trova ripetuto e rimescolato ad altri in proteine più complesse.

Selezione naturale e famiglie

L'evoluzione molecolare è avvenuta selezionando le molecole più utili e stabili, tra i composti formati casualmente. Per una lunghezza tipica di una proteina di circa 300 amminoacidi, si potrebbero teoricamente costruire più di 10³⁰⁰ diverse catene polipeptidiche, di cui probabilmente meno di 10²⁰ adottano una conformazione tridimensionale singola e stabile. È quindi praticamente impossibile che tutti i domini e tutte le proteine si siano formati casualmente come i più elementari composti organici.

L'evoluzione delle proteine è avvenuta ricombinando e selezionando i domini già esistenti, in base alle necessità. L'omologia delle sequenze amminoacidiche suggerisce relazioni funzionali ed evolutive tra le proteine. Nell'evoluzione, la sequenza amminoacidica è tendenzialmente meglio conservata della sequenza nucleotidica, perché un amminoacido può essere codificato da triplette diverse. Attraverso lo studio delle omologie di sequenza si possono costruire alberi evolutivi di proteine e di sequenze di DNA. Esso mostra come una proteina ancestrale si sia evoluta in proteine diverse nelle diverse specie.

Conformazione e modificazione delle proteine

Una catena polipeptidica appena sintetizzata assume la sua conformazione tridimensionale attraverso il folding. Il processo è reversibile, perché l'informazione sul ripiegamento è contenuta nella sequenza amminoacidica, che essendo formata da legami covalenti, non è coinvolta nella denaturazione. Diventa irreversibile, qualora si esponesse la proteina a condizioni più estreme di pH e temperatura. Il processo di ripiegamento in vitro è inefficiente, mentre in vivo risulta essere molto più rapido ed efficiente, in quanto il folding in vivo è svolto da chaperoni e chaperonine.

Gli chaperoni Hsp70 (Heat Shock Protein 70 kilodaltons) si legano alle catene polipeptidiche in fase di allungamento, impedendo che, non ancora completate, instaurino relazioni non fisiologiche, come legarsi ad altre proteine presenti nel citosol. Hanno quindi la funzione di mascherare la presenza della catena polipeptidica incompleta, prevenendo processi patogenetici. Una volta completata la sintesi, le proteine vengono rilasciate e, se è possibile, assumono spontaneamente la loro corretta conformazione. Molti dei polipeptidi più grandi vengono invece trasferiti dalle proteine Hsp70 in un'altra molecola, detta chaperonina. Questi sono dei complessi proteici cilindrici, nel cui interno i polipeptidi neosintetizzati possono ripiegarsi senza subire interferenze, evitando la formazione di legami con ligandi inappropriati.

Spesso la proteina subisce poi modificazioni chimiche per generare la proteina finale. È importante che tutte le molecole di una data specie assumano la conformazione più stabile, quindi più spontanea, definita stato nativo. La proteina deve anche essere poi indirizzata al suo compartimento target, dove troverà le condizioni necessarie (es. pH, concentrazione salina) per il raggiungimento della sua forma funzionalmente attiva. Le chaperonine sono proteina-specifiche, regolano il loro ambiente interno per permettere il ripiegamento corretto e trasportano le proteine al compartimento target, nascondendole al resto della cellula.

Patologie legate al misfolding

Queste patologie includono condizioni in cui una proteina:

• Non riesce a raggiungere il folding nativo: fibrosi cistica, sindrome di Marfan e sclerosi laterale amiotrofica (SLA)
• Non sono sufficientemente stabili per svolgere le loro normali funzioni: molte forme di cancro
• Non sono trasportate nel luogo corretto: ipercolesterolemia familiare e deficienza di α₁-antitripsina
• Formano degli accumuli insolubili all'interno della cellula, che precipitano e superano la capacità della cellula di degradarli, risultando tossici: malattia di Alzheimer, diabete di tipo II e malattia di Parkinson

Nel morbo di Alzheimer si ha l'accumulo di placche amiloidi, ovvero accumuli di filamenti proteici aberranti, il cosiddetto β-peptide amiloide. Questi sono derivati da una proteina transmembrana delle cellule nervose, chiamata proteina precursore dell'amiloide, che nei soggetti malati viene erroneamente tagliata.

Interazioni

Le proteine interagiscono con i ligandi, in porzioni chiamate siti di legame, grazie all'affinità di forme e di tipologie di legame che formano. Le interazioni delle proteine devono essere stabili e reversibili, in quanto la stabilità è necessaria per garantire il contatto per il tempo necessario a svolgere l'azione specifica, mentre la reversibilità è necessaria per permettere alla proteina di tornare al suo stato originario. Queste caratteristiche sono tipiche dei legami deboli, infatti le proteine legano i ligandi con legami non covalenti.

Il legame è versatile, come si nota soprattutto negli anticorpi, strutture proteiche capaci di legare virtualmente un numero infinito di antigeni. Questa varietà è ottenuta grazie al cambiamento di sequenza degli amminoacidi delle "anse" del sito di legame, senza alterare la struttura di base della proteina. La figura mostra come una proteina interagisca con ligandi diversi attraverso legami di forza e stabilità diversi a seconda del grado di affinità tra il sito di legame e il ligando.

Regolazione dell'attività biologica

Le cellule, in risposta a stimoli endogeni o esogeni, regolano l'attività delle proteine, in due modi:

• Regolazione allosterica

  La funzione regolatoria è svolta su una sezione di proteina, chiamata sito allosterico, distinguibile dal sito attivo dove avviene la reazione. È indotta dal legame di una piccola molecola, che può essere un effettore attivatore o un effettore inibitore, che innesca cambiamenti a livello della struttura tridimensionale, andando a aumentare (attivazione) o diminuire (inibizione) l'affinità del sito di legame per il substrato. Le proteine regolabili per allosteria sono solitamente polimeriche, ovvero con subunità catalitiche diverse dalle subunità regolatorie.

  La regolazione allosterica prende diverse forme, come il rilascio allosterico di subunità catalitiche dall'enzima chinasi dipendente (cAPK) dalla ciclina-AMP (cAMP). Questo enzima è una proteina multimerica, formata da quattro subunità, di cui due subunità regolatorie R e due subunità catalitiche C. In assenza di AMP-ciclico (cAMP), l'enzima è inattivo, perché le due subunità R occupano i siti attivi delle subunità C grazie a pseudosubstrati. In presenza di AMP-ciclico (cAMP), esso si lega alle subunità R, cambiandone la conformazione e riducendo l'affinità degli pseudosubstrati per i siti attivi, che vengono così liberati e possono catalizzare una reazione. Il legame di molti ormoni a recettori cellulari di superficie induce un innalzamento della concentrazione intracellulare di cAMP, portando all'attivazione di cAPK. Quando il segnale cessa, il cAMP diminuisce e l'attività di cAPK viene inibita.

• Regolazione per modificazione covalente

  La regolazione dell'attività proteica passa anche attraverso l'aggiunta di:

  • Gruppi fosfato
  • Gruppi metilici
  • Acetile
  • Ubiquitina
  • SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier, sumoilazione)

  L'aggiunta di questi crea un codice aggiuntivo alla catena di amminoacidi, che porta un significato regolatorio. Uno dei meccanismi più diffusi di regolazione dell'attività enzimatica è la fosforilazione, grazie a enzimi chinasi, e defosforilazione, grazie a enzimi fosfatasi, sui residui amminoacidici della serina, treonina o tirosina. Ogni enzima subisce una regolazione propria dall'aggiunta e dalla rimozione dei gruppi fosfato, per cui non si può affermare universalmente che defosforilato vuol dire inattivo o fosforilato vuol dire attivo. Anche sulla stessa proteina, fosforilazione e defosforilazione possono inibire o aumentare l'attività a seconda del sito di fosforilazione e della struttura.

  A volte sono necessari più eventi sequenziali per l'attivazione di una proteina. In questo caso abbiamo dapprima la rimozione del fosfato, che induce un cambiamento conformazionale della proteina stessa, che poi, a sua volta, permette il legame del ligando nel dominio SH3 della proteina. A seguito, il gruppo chinasico può fosforilare un residuo di tirosina, serina o treonina auto-attivante. Nel caso di una proteina Cdk chinasi le condizioni di attivazione sono:

  • Questo gruppo fosfato è stato rimosso?
  • Questo gruppo fosfato è stato aggiunto?
  • È presente la ciclina?

  Nel caso di una protein chinasi di tipo Src le condizioni di attivazione sono:

  • Questo gruppo fosfato è stato rimosso?
  • Questo legame è stato rotto?
  • Questo gruppo fosfato è stato aggiunto?

  In questo caso, la rimozione di fosfato fa sì che si distruggano i legami in un'altra regione della proteina, modificandone la struttura e permettendo quindi l'aggiunta di un gruppo fosfato in un'altra zona, rendendo la proteina attiva.

Taglio proteolitico

Un altro modo di attivare le proteine è il taglio proteolitico. Spesso delle proteine vengono sintetizzate come coenzimi, con un tratto di peptide ancora attaccato, che ne impedisce la conformazione attiva. Per attivarle è necessario quindi che il tratto di peptide in eccesso venga tagliato dalle proteasi, enzimi in grado di rompere legami peptidici. Un esempio classico è quello degli enzimi proteasici, sintetizzati a livello del pancreas.