Pcr, elettroforesi, dna ricombinante, enzimi di restrizione

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono particolari enzimi capaci di riconoscere e tagliare delle sequenze specifiche di DNA.

Tipologie di enzimi di restrizione

Si suddividono in:

• Endonucleasici → quando rompono i legami all'interno della sequenza
• Esonucleasici → quando rompono i legami che sono all'estremità della sequenza

Sottocategorie in base alla tipologia

• Tipo I: sono poco specifici; riconoscono sequenze lontane dal sito di riconoscimento; hanno bisogno di energia per effettuare il taglio
• Tipo II: altamente specifici; riconoscono sequenze di 4-6 basi definite sequenze palindromiche (si leggono da dx verso sx e viceversa); tagliano il sito di riconoscimento; sono quelli maggiormente utilizzati; non hanno bisogno di energia
• Tipo III: sono poco specifici; tagliano vicino al sito di riconoscimento; hanno bisogno di energia per effettuare il taglio

Tipologie di tagli degli enzimi di restrizione

I tagli degli enzimi di restrizione:

• Blunt ends: formazione di estremità piatte
• Sticky ends: formazione estremità appiccicose

Sono preferibili, perché la DNA ligasi appaia meglio i legami.

Nomenclatura degli enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione hanno una nomenclatura ben precisa:

• EcoRI
• E (prima lettera): indica il genere
• co (seconda e terza): indicano la specie
• R (quarta lettera): indica il ceppo
• I (numero): indica l'ordine in cui è stato isolato

Gli enzimi di restrizione sono utilizzati per la rilevazione dei polimorfismi e per il DNA ricombinante.

DNA ricombinante

Il DNA ricombinante è una porzione di genoma prelevato da un organismo e inserito all'interno di un organismo ospite affinché quest'ultimo possa replicarlo.

Fasi del DNA ricombinante

1. Taglio con enzima restrizione → il DNA viene estratto e digerito con un enzima di restrizione
2. Separazione dei frammenti → i frammenti di DNA ottenuti con l'enzima vengono separati mediante elettroforesi
3. Identificazione del gene → per trovare il gene di nostro interesse il DNA viene ibridato con metodologia blotting (con sonde geniche)
4. Preparazione vettore di clonaggio → il vettore di clonaggio è un sistema che contiene il frammento di DNA di nostro interesse e che verrà inserito nell'ospite. I vettori utilizzati maggiormente sono: virus, cosmidi, plasmidi.

Plasmide

Plasmide: molecola circolare di DNA extracromosomico in grado di replicarsi autonomamente. Presenta:

• Sito clonaggio (una sequenza per ogni enzima)
• Marcatore selettivo (per riconoscere le cellule con plasmide)
• Origine replicazione (per avere replicazione del vettore)

Per preparare il vettore di clonaggio vengono utilizzati gli enzimi di restrizione. Questi tagl