Patologia Vegetale - Marzia Beccaccioli - Laboratorio per lo studio dei materiali di origine vegetale

La cellulosa

Si tratta del polimero più abbondante in natura, è composto da unità monomeriche di cellobiosi o glucosio. L'unità ripetuta è un dimero, ossia un dimero di glucosio legato beta 1-4, ossia un legame in equatoriale che impacchetta la struttura rendendola rigida. Legami di questo tipo portano alla formazione di una struttura lineare, tipica della cellulosa che è perciò caratterizzata dalla presenza di lunghe fibrille legate fra di loro attraverso ponti idrogeno. Questo determina una certa rigidità che è quella che serve alle piante per sostenersi, cioè è proprio la natura stessa del legame che porta alla formazione di queste lunghe fibrille, organizzate in modo molto coeso detto cristallino. La cellulosa, avendo tale struttura, risulta un polimero complesso da degradare; sono relativamente pochi gli organismi in grado di farlo, infatti sono necessari specifici enzimi che devono cooperare per scindere completamente la molecola di cellulosa. Perciò è necessario scompaginare la struttura affinché gli enzimi riescano a degradare le macromolecole. Molti funghi presentano tali enzimi.

Cellulosolisi

La cellulosolisi è il processo complesso che porta alla degradazione della cellulosa ed è dovuto a un complesso enzimatico, la cui secrezione è sincronizzata dall’organismo. Tale sincronizzazione avviene a livello dei fattori di trascrizione che devono percepire segnali dall’esterno per dare avvio alla sintesi di quel gene nel momento opportuno (un enzima è prodotto a partire da un RNA messaggero che segue le istruzioni del DNA). I fattori di trascrizione sono delle proteine che si legano vicino al gene, in una zona detta promotore, che reclutano il complesso del RNA polimerasi che trascrive il gene; questo è tradotto e trasformato nell’enzima che viene secreto. Alla fine del lavoro degradativo di ogni singolo enzima che fa parte del complesso cellulosolitico, si libera un dato substrato che fa da segnale alla produzione del successivo enzima. Perciò il primo enzima che interviene porta alla produzione di un secondo enzima che serve ad attivare, a sua volta, un altro enzima. Si tratta di una famiglia composta da tre enzimi che degradano la cellulosa.

Tipi di enzimi cellulosolitici

• Esoglucanasi: Degradano il polimero di cellulosa attaccando le estremità riducenti del polimero o degli oligomeri (poche molecole di glucosio). Le estremità riducenti si formano quando, ad esempio, si rompe una fibrilla di cellulosa per azione dell’acqua o quando intervengono altri enzimi che causano delle rotture all’interno del polimero di cellulosa, ossia le endoglucanasi.
• Endoglucanasi: Queste rompono la fibrilla attaccando i legami in mezzo alla catena di cellulosa e formano degli oligomeri in cui tutte e due le estremità sono riducenti. Questi grandi frammenti, successivamente, intervengono ancora con le esoglucanasi che riducono tutto in oligomeri molto piccoli, ossia dimeri e trimeri (cellobioso e cellotriosio).
• Beta-glucosidasi: Degradano i dimeri e i trimeri in glucosio e rendono perciò disponibile il glucosio per la crescita cellulare dell’organismo.

Quando sul substrato sono presenti zuccheri semplici, questi vanno a inibire la sintesi delle cellulasi.

Degradazione della pectina

La pectina è il principale componente della lamella mediana, si tratta di un eteropolimero ramificato con catena principale generalmente formata da acido galatturonico (zucchero). La pectina può essere distinta in tre diverse conformazioni, due delle quali sono dette homogalatturonano e ramnogalatturonano perché hanno diversi residui metilici. Una è detta conformazione più complessa, la quale presenta monomeri di ramnosio in corrispondenza dei quali si innestano catene laterali più o meno lunghe che contengono vari zuccheri: galattosio, arabinosio, xilosio etc. La pectina è spesso usata in campo artistico per la produzione di collanti o ammendanti per colori. Può essere oggetto di degradazione enzimatica causata da batteri e funghi che, essendo organismi eterotrofi e spesso saprofiti, si nutrono attraverso la produzione di metaboliti secondari di tessuti morti di piante, animali e vari materiali derivati.

Degradazione della lignina

La lignina è uno dei polimeri più abbondanti in natura. È una componente della parete secondaria e forma uno stretto legame con la cellulosa. Infatti, molto spesso si parla di componente ligneo-cellulosica. Questo legame fa in modo che la cellulosa presente nelle fibre di un papiro o di una tela sia più difficilmente attaccabile perché complessata con la lignina (oggi, paradossalmente, la lignina viene eliminata attraverso processi di purificazione della cellulosa). La lignina costituisce la parte predominante del legno, che è la struttura portante delle piante arboree. La lignina forma un network tridimensionale, in cui si individuano tre composti fenolici (alcool aromatici): alcool cumarilico, coniferilico, sinapilico. La degradazione di questo polimero libera sostanze che hanno un potere antimicrobico, sostanze fenoliche che sono potenzialmente tossiche contro il microorganismo stesso che ha degradato il legno. Molti organismi possono comunque degradare la lignina attraverso enzimi ligninolitici. Questi enzimi possono degradare la lignina attraverso due modalità:

Ligninolisi

• La rottura dell’anello fenolico: dell’anello benzenico.
• La rottura della trama: attraverso un’attività perossidasica, cioè usano composti radicalici come il perossido d’idrogeno o altri perossidi presenti nell’ambiente e utilizzandoli come donatori e accettori di elettroni possono rompere questo legame riducendo l’ossigeno. Le due modalità vengono svolte dalla ligninasi una macrocategoria di enzimi che possono degradare la lignina.

Un elemento comune è la presenza di un cofattore, ossia un metallo, che può essere presente all’interno di questi enzimi. La presenza di questi metalli è importante perché serve per lo scambio di elettroni che mediano la reazione di ossidazione. Lignina-perossidasi (contiene ferro) e manganese-perossidasi (contiene manganese) agiscono entrambi sulle unità non aromatiche, perciò sulla parte o di legame con la cellulosa o si legame inter-fenolico, tra le molecole fenoliche che formano il reticolo. Tutti questi enzimi contengono metalli che fungono come accettori o donatori di elettroni. La laccasi è una fenolo-ossidasi che ossida l’anello aromatico (contiene 4 atomi di rame) e degrada la lignina molto più aggressivamente perché degrada direttamente gli anelli fenolici, agisce anche questa attraverso un meccanismo di ossido-riduzione. Mentre nel caso della cellulosolisi il substrato che induce gli enzimi è la cellulosa amorfa e gli oligomeri di cellulosa, nel caso della ligninolisi il substrato che induce gli enzimi non è la lignina stessa ma alcuni componenti derivati da fenomeni di ossidazione causati da questi enzimi, composti quali radicali liberi, ossia, molecole molto reattive. Spesso non è l’enzima stesso che va ad attaccare la lignina e rompe i legami che tengono insieme alcoli e trama, ma sono i radicali liberi a rompere i legami, come i perossidi, alcool veratrilico etc. Queste molecole sono molto reattive perciò possono attaccare diversi legami e indurre la rottura delle molecole.

Articolo

Questo studio risalente a diversi anni fa dimostra come il fungo Trametes versicolor, un fungo ligninolitico, che presenta la produzione di alcuni enzimi che sono in grado di degradare la lignina, produce infatti la laccasi e la manganese perossidasi, ossia due enzimi impiegati nella produzione di specie reattive dell’ossigeno e sono queste specie reattive che mediano la degradazione della lignina. Questi enzimi in presenza di determinati substrati vanno a formare delle specie reattive dell’ossigeno, queste specie reattive vanno ad attaccare sia la trama sia l’anello fenolico della lignina. Il Trametes versicolor è un basidiomicete, un fungo che forma un tipico carpofero. In laboratori siamo in grado di studiare l’attività ligninolitica, molto spesso vengono usati dei saggi enzimatici, l’attività ligninolitica può essere studiata attraverso il substrato syringaldazina. Ad esempio, se vogliamo sapere se un certo fungo, ad esempio il Trametes versicolor, produce degli enzimi che sono in grado di digerire la lignina, quello che sappiamo è che possiede tre laccasi, ossia tre enzimi con residui di rame che mediano l’attività ligninolitica. Per vedere se questo fungo produce effettivamente degli enzimi, si studia il substrato su cui viene coltivato (in condizioni favorevoli affinché svolga tutte le attività metaboliche). Il substrato si studia attraverso un saggio enzimatico, ossia si usano dei reagenti che permettono una reazione di ossidazione. La syringaldazina viene usata perché nelle normali condizioni è di colore giallo, ma a contatto con l’enzima laccasi ad un preciso pH 7.5 e una temperatura di 30°C, allora il colore varia verso il viola. Lo studio viene effettuato con lo spettrofotometro, uno strumento che emette ad una certa lunghezza d’onda. Solitamente è impostato nel visibile, e quando un composto subisce una reazione va ad emettere ad una lunghezza d’onda differente e si può misurare quella lunghezza d’onda di emissione che è tipica della reazione. La reazione porta ad una perdita di 4 elettroni che reagendo con l’ossigeno formano H₂O.

I funghi

Regno del dominio Eucariota. Le specie funginee conosciute sono circa 5.000.000. Il riconoscimento, in passato, avveniva attraverso sezioni morfologiche, quindi attraverso i corpi fruttiferi, le spore sessuali etc., attraverso l’esame visivo e microscopico vennero riconosciuti circa 100.000 specie. Ma con lo sviluppo della biologia molecolare si è andato a vedere che in un campione di suolo erano presenti migliaia di specie non descritte prima. I funghi hanno una cellula molto simile a quella degli animali. Infatti, pur essendo protette da una parete cellulare, così come le piante, nei funghi questa ha una composizione molto più simile a quella degli esoscheletri degli insetti: è infatti formata da chitina, un polimero formato da unità di N-acetilglucosammina. Sono organismi eterotrofi perché non svolgono la fotosintesi, utilizzano al più la luce per i ritmi circadiani e controllare la produzione di metaboliti secondari. Infatti, si nutrono per assorbimento, cioè il fungo secerne all’esterno gli enzimi digestivi, i quali lisano la materia organica per idrolisi - rottura di un polimero organico che porta alla formazione di molecole organiche più piccole. La maggior parte dei funghi sono saprofiti, quindi crescono su materiale organico morto. Infatti, svolgono una funzione di biodegrado, sono dei decompositori straordinari perché crescono su qualsiasi tipo di matrice, crescono su teli di plastica, su materiali inorganici, sono stati ritrovati in zone fortemente inquinate da pesticidi, o radioattività.

Tipi di funghi litolitici

I funghi litolitici, detti black fungi, crescono sul travertino, perciò si adattano a tantissimi substrati. Oltre ad essere agenti biodeteriogeni di manufatti, sono anche patogeni di piante ed animali: possono essere anche dei parassiti. Alcuni substrati su cui crescono i funghi sono molto acidi come il limone su cui cresce Penicillium italicum, ma anche carte e altri substrati legati ai beni culturali possono essere molto acidi e questo non li protegge dall’attacco fungineo. I funghi hanno una morfologia molto semplice: non hanno organi, non hanno tessuti ma sono organizzati in un fitto reticolo di cellule allungate chiamate ife, tante ife funginee formano un micelio, e di conseguenza possono crescere per svariati chilometri. Sono divisi in due gruppi in base alla struttura delle ife:

• Coenomiceti: I quali hanno ife cenocitiche, ossia le cellule non sono divise l’una dall’altra, non sono presenti pareti trasversali, probabilmente all’inizio i funghi appartenevano tutti a questa categoria perché sono quelli che hanno mantenuto più caratteri arcaici.
• Dicariomiceti: Presentano ife settate, le cellule sono separate da pareti trasversali. In particolare modo quest’ultimi costituiscono corpi fruttiferi e comprendono gli Ascomiceti, il cui corpo fruttifero è detto ascocarpo, e i Basidiomiceti, il cui corpo fruttifero è detto basidiocarpo.

Alcuni funghi sono strettamente biotrofici, hanno bisogno di un ospite per completare il ciclo vitale, questa incapacità può essere declinata in due modi: uno positivo, perché nel momento di una simbiosi mutualistica tra fungo e pianta, o fungo e animali, c’è un vantaggio per entrambe le parti, ognuno ne ricava una situazione positiva, ad esempio i funghi micorrizzici per le piante. Questa biotrofia può essere negativa quando il fungo è parassita quindi trae solo nutrimento, come nel caso della formica zombi. I funghi si riproducono mediante la diffusione delle spore infatti hanno una capacità riproduttiva molto elevata, in quanto le spore possono viaggiare nell’aria anche per migliaia di chilometri prima di posarsi e ricominciare il ciclo vitale. Ogni fungo può produrre miliardi di spore, prodotte per mitosi: legata alla riproduzione asessuale, dove non c’è rimescolamento genetico. Questa è messa in atto quando il fungo si trova in una condizione ideale (più corretto parlare di conidi e non spore); meiosi: legata alla riproduzione sessuale.

Classificazione dei funghi

• Coenomiceti Dicariomiceti
• Zigomiceti Basidiomiceti
• Chitidriomiceti Ascomiceti
• Glomeromiceti

Le spore dei funghi sono strutture resistenti che rimangono latenti anche per lunghissimi tempi e che in condizioni favorevoli riprendono il loro ciclo vitale. Le spore sono generalmente di due tipi: abbiamo spore originate da un ciclo asessuale dette conidi, si tratta di mitospore aploidi prodotte per mitosi. Nella riproduzione sessuale vengono prodotte meiospore aploidi. Nel caso degli Ascomiceti abbiamo le ascospore che si formano sui corpi fruttiferi detti ascocarpi i quali formano gli Aschi. Nel caso dei Basidiomiceti le basidiospore sono generate da corpi fruttiferi detti basidiocarpi. Nei musei la tipica apertura delle porte può tranquillamente portare l’ingresso di spore funginee così come l’ingresso di visitatori che le possono emettere con respiri o trasportare sui vestiti. Se le spore si posano sull’opera d’arte, crescendo si può nutrire del substrato andando a degradare i materiali di cui è fatto, pigmenti, collanti, fissativi etc. Inoltre, il cambiamento climatico ne favorisce la crescita perché quantità molto elevate di pioggia in poche ore aumentano incredibilmente la quantità di umidità ambientale. Spesso risentono i materiali esterni come tufo che assorbe acqua e la combinazione delle spore che si sono posate su quel substrato ha favorito la crescita del micelio.

Inizio nuovo ciclo vitale

Le spore in condizioni di dormienza riescono comunque ad assorbire le sostanze esterne disciolte nell’acqua che viene assorbita dalla spora stessa, così questa si gonfia e inizia un processo di germinazione. La spora si nutre perciò di questi nutrienti semplici per dare origine alla prima ifa e poi inizia la ramificazione del micelio. Il fungo inizia così a produrre e secernere degli enzimi, cioè delle proteine con proprietà enzimatica che degradano il substrato fatto da macromolecole complesse come polisaccaridi, lipidi o proteine e le trasformano in elementi più semplici. La cellulosa viene ridotta a glucosio e l’ingestione del materiale avviene attraverso endocitosi. I funghi sono classificati in categorie ecologiche in base al grado di temperatura e umidità che riescono a sopportare e quindi sopravvivere. Possono svilupparsi in un vastissimo range di parametri ambientali quali pH, temperatura, umidità, e quantità di ossigeno. Possono dividersi in:

• Psicrofili: quelli che crescono a basse temperature (dai 0 ai 20 gradi).
• Mesofili: a temperature moderate.
• Termofili: crescono ad alte temperature (dai 40 ad un massimo di 60 gradi).

Anche percentuali di ossigeno come ossigeno all’1% può portare allo sviluppo di ife funginee e quindi alla formazione del micelio. Perciò, in passato quando si usava conservare i libri ad esempio, in una percentuale bassa di ossigeno si è poi compreso che era meglio andare verso all’anossia piuttosto che all’ipossia. La presenza di acqua è fondamentale per la crescita funginea, oggi sappiamo che ogni matrice è in grado di cedere una certa quantità di acqua all’ambiente e subisce delle variazioni anche in base alla quantità di acqua che è già presente nell’ambiente, infatti vi è uno scambio continuo tra ambiente e matrice. Perciò il parametro dell’acqua libera è fondamentale: si tratta della capacità di una determinata matrice di cedere acqua all’ambiente. L’acqua che in quel momento si trova dentro alla matrice non è legata covalentemente alla matrice stessa, quindi non è legata in modo forte. Perciò, un cambiamento dell’umidità e delle temperature esterne può far sì che venga ceduta all’ambiente: cioè la matrice cede acqua in base alle condizioni dell’ambiente in cui si trova. È un’acqua che normalmente è presente all’interno della matrice e che diventa a disposizione di microorganismi che vogliono crescere.