Patologia clinica

B1 – PATOLOGIA CLINICA

Introduzione

La patologia clinica, detta anche medicina di laboratorio, analisi clinica o biologia clinico medica, è quella

branca della medicina che applica le tecniche di indagine della patologia. Serve per integrare le informazioni

della semeiotica clinica nel processo di diagnosi della malattia. Serve a capire cosa non va in un paziente

iniziando a capire diagnosi e prognosi attraverso dei test specifici; seguiti dallo screening, monitoraggio,

determinazione dei valori basali e decisione, i cui ultimi 3 punti sono ruolo dell’infermiere.

Nella medicina moderna l’80% delle informazioni sono prodotte nei laboratori di Chimica Clinica e

Fisiopatologia attraverso lo studio di biomarcatori o marcatori biologici, che sono dei parametri biologici

misurabili e quantificabili che servono da indicatori per la valutazione di fisiopatologia e salute, servono

quindi per la distinzione tra salute e patologia. Questi si possono classificare in:

− Biomarcatore di tipo 0, marker della storia naturale della malattia e che correlano longitudinalmente

con gli altri indicatori della malattia stessa;

− Biomarcatore di tipo 1, riflettono gli effetti di un intervento terapeutico e sono correlati al

meccanismo di azione del farmaco;

− Biomarcatore di tipo 2, sono correlati allo stato clinico ovvero indicano l’avanzamento della malattia

stessa.

Esistono diversi tipi di biomarker genomici: i biomarker di rischio agiscono sul fenotipo clinico sia

direttamente sia attraverso i fenotipi biochimici intermedi come il proteoma e il metaboloma. Sulla malattia

clinica hanno influenza anche i biomarker genomici di risposta, che caratterizzano la responsività individuale

alle terapie e la medicina personalizzata. Si possono utilizzare come indicatori di rischio di malattia in soggetti

sani come per la mutazione BRCA nel cancro della mammella, come indicatori di malattia presintomatica,

come lo screening prima della comparsa delle complicazioni o in atto, tutti i segni biochimici tipici della

malattia, come indicatori di evoluzione della malattia, nella stadiazione dei tumori, marker prognostici o di

gravità del processo e come indicatori di efficacia di una terapia come nei tumori. Prima che un biomarcatore

entri in uso diagnostico si distinguono diverse fasi:

− Scoperta e identificazione del biomarcatore con la ricerca di base;

− Validazione del candidato biomarcatore attraverso studi clinici preliminari su pazienti selezionati;

− Standardizzazione del sistema diagnostico con la procedura per la sua valutazione che viene

verificata e standardizzata;

− Validazione clinica attraverso la valutazione della sensibilità e della specificità diagnostica del metodo

di dosaggio;

− Applicazione clinica attraverso la valutazione dell’efficacia e degli effetti dell’introduzione in clinica

del biomarcatore;

− Introduzione nella pratica clinica.

Un laboratorio di patologia clinica è composto da professionalità specializzate come medici, biologi,

biotecnologici, infermieri e informatici, da un laboratorio centrale generale, di solito in un ospedale fornisce

tutte le prestazioni in ematologia, chimica clinica, microbiologia e immunologia ed un elevato livello di

automatizzazione nelle valutazioni, auspicabile ma non sempre ottenibile. I diversi tipi di laboratorio, di

reparto, generale o specialistico, sono inseriti in un sistema di servizi di controllo che ne valuta la qualità del

prodotto, le condizioni lavorative, la corretta utilizzazione del dato e l’economicità delle spese. I laboratori

sono supportati da una serie di servizi non laboratoristici, amministrativi, informatici, tecnici e manutentivi.

Alle singole strutture sono sovraordinati i laboratori di riferimento con bacini di utenza regionale o nazionale

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e le strutture scientifiche e di controllo che elaborano i valori di riferimento e sovraintendono ai registri

epidemiologici.

Il ciclo analitico è composto dall’accettazione del campione, verifica del campione e centrifugazione che

portano al referto, dopo di chè si ha la suddivisione del caricamento, l’analisi, validazione, eventuale

ripetizione e infine la refertazione finale. La parte della centrifugazione è considerata la parte più lunga e

altamente pericolosa. Sono importanti anche le procedure preanalitiche con la descrizione accurata di:

procedure da seguire per i prelievi, come identificare il paziente e come rintracciarlo, trasporto dei campioni,

criteri di accettazione e rifiuto per ogni tipologia di analisi, gestione dei test in urgenza ed emergenza e

conservazione dopo l’iter analitico per ripetere eventualmente il test. Qui è compresa la variabilità

preanalitica che riguarda le modificazioni reali che intervengono in un campione dal momento della raccolta

dell’analisi e possono essere dovute al prelievo e al trasporto. I valori di riferimento sono degli indicatori e

sono importanti da sapere come la distribuzione di riferimento che comprende la distribuzione statistica dei

valori di riferimento osservati nel gruppo campione di riferimento, limiti di riferimento che sono derivati dalla

distribuzione di riferimento e utilizzati per descrivere lo scostamento dalla media di una data percentuale dei

valori di riferimenti, intervalli di riferimento che rappresentano la popolazione compresa tra due limiti di

riferimento e valore osservato, come valore ottenuto ai fini di una decisione medica e può essere comparato

con la distribuzione, i limiti e gli intervalli di riferimento.

La venipuntura è una procedura che prevede l’ispezione di entrambe le braccia, evitando i punti di abrasione,

cicatrici, ematomi ed eritemi circostanti la vena; applicare il laccio emostatico nella parte superiore del

braccio ad una distanza di 7/10 cm del sito prescelto, il laccio deve stringere in modo tale da aumentare la

pressione del sangue nella vena senza arrestarne la circolazione. Solitamente i siti prescelti sonno la vena

cefalica o la vena mediana del gomito o mediana cefalica, esse sono da preferire in quanto sono vasi grandi,

ben fissati ai tessuti circostanti e situati nel centro dell’area antecubitale. Per rendere più facile

l’individuazione della vena: porre il braccio verso il basso, massaggiare l’area antecubitale dal basso verso

l’alto, far aprire e chiudere la mano e palpare la zona del prelievo con l’indice della mano per riconoscere la

vena. È importante anche la disinfezione con clorexidina al 2% in soluzione idroalcolica oppure con

iodopovidone al 10% in soluzione acquosa. Ma non è da sottovalutare il rischio biologico in quanto qualsiasi

individuo deve essere considerato potenzialmente infetto, e il rischio non è solo per l’operatore ma anche

per il donatore; per questo è importante prima di ogni procedura effettuare un corretto lavaggio delle mani,

ispezionare il punto di venipuntura per eventuali lesioni cutanee, usare dispositivi di protezione come guanti,

mascherine e occhiali e usare procedure corrette di disinfezione, sterilizzazione e smaltimento. È importante

l’identificazione ed etichettatura della provetta.

Emostasi

L’emostasi è una serie di reazioni biochimiche e cellulari, sequenziali e sinergiche, che hanno lo scopo di

impedire la perdita di sangue dai vasi. È un meccanismo di difesa, finalizzato al mantenimento dell’integrità

dei vasi sanguigni e della fluidità del sangue. Un aumento dell’emostasi porta a trombosi, una diminuzione a

emorragie. Si parla di equilibrio coagulativo – litico, che comporta protezione dalla trombosi e dall’emorragia.

Le fasi del processo emostatico sono: vascolare, maggiore a 1 ora, in cui si ha la contrazione della muscolatura

vasale, con lo scopo di ridurre il lume vascolare, piastrinica, meno di 10 minuti, che comporta l’adesione, la

risposta biochimica, lo shape change, la degranulazione e l’aggregazione delle piastrine, con formazione di

tappo piastrinico, coagulativa, maggiore a 10 minuti, in cui vengono attivate delle proteasi plasmatiche, con

formazione del coagulo di fibrina, fibrinolitica, 1 o 2 minuti, con attivazione del sistema fibrinolitico e

dissoluzione del coagulo. Lo scopo finale è la riparazione della lesione vascolare.

La fase vascolare è il primo evento del processo emostatico, comporta la contrazione delle cellule della tunica

media, più evidente nei vasi con parete muscolare ben definita, serve per ridurre momentaneamente la

perdita di sangue, la stimolazione dei nerva vasorum, il rilascio di endotelina dall’endotelio, il rilascio di

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serotonina piastrinica. La vasocostrizione, dovuta a meccanismi neurogeni riflessi e a fattori umorali come

l’endotelina ed è utile a ridurre momentaneamente al perdita di sangue.

Nella fase piastrinica si hanno: l’adesione al sottoendotelio, attivazione piastrinica con innesco delle vie di

trasduzione del segnale, cambiamento di forma (shape change) con emissioni di pseudopodi, secrezione

piastrinica con rilascio del contenuto dei granuli piastrinici, aggregazione piastrinica primaria, reversibile,

viene formato il tappo emostatico primario, aggregazione piastrinica secondaria, irreversibile, viene formato

il tappo emostatico secondario. La lesione delle cellule endoteliali espone il tessuto connettivo

sottoendoteliale altamente trombogenico, al quale le piastrine aderiscono entrando in uno stato di

attivazione che comporta un cambiamento nella forma piastrinica e una reazione di esocitosi. I fattori che si

liberano dai granuli piastrinici come ADP, TXA2, serotonina ed altri, reclutano ulteriori piastrine che

aggregano sopra le prime, così da formare il tappo piastrinico. Tale reazione piastrinica avviene entro pochi

minuti dalla lesione e, insieme alla vasocostrizione, costituisce la cosiddetta emostasi primaria. Se si tratta di

lesioni capillari quest’emostasi è sufficiente per riparare il danno. 3 3

Le piastrine sono frammenti del citoplasma dei megacariociti, sono circa 150 – 400 x 10 /mm e hanno vita

media di 10 – 12 giorni, hanno forma discoidale con un diametro di 1 – 4 micron, e spessore di 1 micron, non

hanno nucleo, hanno un fascio equatoriale di microtubuli e microfilamenti, hanno plasmamembrana e

glicocalice, un sistema canicolare aperto, un RE liscio e un sistema tubulare denso, lisosomi detti anche

granuli lambda che contengono enzimi lisosomiali, granuli alpha che contengono proteine adesive come

fibrinogeno, fibronectina, fattore di von Willebrand, trombospondina, fattori della coagulazione come il

fattore V, HMWK, C1 inibitore, fibrinogeno, fattore XI, proteina S e PAI 1, granuli delta i corpi densi che

contengono agonisti dell’aggregazione come ADP, ATP, Ca, serotonina. Sulla superficie delle piastrine ci sono

alcune importanti proteine come GpIa/IIa il recettore per il collageno, GpIc/Iia, recettore per la fibronectina,

il recettore per la vitronectina, GpIIB/IIIa, recettore per il fibrinogeno, GpIc/IIa, recettore per la laminina,

GpIb/IX, recettore per il fattore di von Willebrand e GpIV recettore collageno o trombospondina. L’endotelio

integro e la superficie piastrinica si respingono in virtù delle loro cariche negative, la perdita dell’endotelio

espone il collageno sottoendoteliale, che lega la GpIa, la GpIb si lega al vWF a sua volta adeso al collageno, si

ha così l’adesione piastrinica. Il fattore di von Willebrand, un multimero, è prodotto dall’endotelio e circola

nel plasma. I multimeri ad alto peso molecolare hanno maggiore affinità per le piastrine.

In seguito all’adesione le piastrine attivano i meccanismi di trasduzione che determinano il cambiamento di

forma con la contrazione dei microtubuli e dei filamenti di actomiosina e la reazione di degranulazione.

L’aggregazione piastrinica si verifica perché il fibrinogeno si pone a ponte tra il GpIIb/IIIa di una piastrina e

quello di altre piastrine. Il fibrinogeno è quindi il collante dell’aggregazione. Il cross linking della

tromnospondina stabilizza il legame. Il fenomeno dell’aggregazione piastrinica è reversibile, poiché le

piastrine tendono a disperdersi e disaggregare con ripresa dell’emorragia, se non interveniente la fase

coagulativa. La fase piastrinica ha quindi notevole importanza nel determinare l’emostasi primaria, ma non

sufficiente per l’emostasi definitiva per lesioni di vasi sanguigni di calibro superiore a 500 micron. Agonisti

dell’aggregazione piastrinica sono il collageno, il trombossano A2, il PAF, l’ADP, la trombina, l’adrenalina con

il recettore alfa, complessi immuni, la vasopressina, la serotonina, la prostaglandina H2, mentre antagonisti

sono la prostaciclina, l’ossido nitrico, la prostaglandina D2, l’adenosina e l’adrenalina con il recettore beta.

I fattori della coagulazione quasi tutti sintetizzati nel fegato, sono serino proteasi presenti nel sangue in

forma di zimogeni, i quali vengono attivati a cascata, fino alla formazione della maglia di fibrina. Fanno

eccezione il fattore V e il fattore VIII, cofattori e fibrinogeno, che non sono serino proteasi. Anche se non si

tratta di fattori propriamente detti, intervengono in modo critico nel processo coagulativo gli ioni Ca, ed i

fosfolipidi delle superfici cellulari, in particolare i fosfolipidi della superficie delle piastrine che vanno sotto il

nome di fattore piastrinico 3 o PF3. Come tutti i grandi sistemi multi proteasici dell’organismo come il sistema

del complemento e quelli fibrinolitico, anche il sistema della coagulazione si organizza spazialmente e

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funzionalmente su basi solide rappresentate dalle superfici cellulari, dove gli ioni Ca hanno funzione di

favorire l’interazione tra enzima, eventuale cofattore e fosfolipidi. Le serino proteasi sono formate dalla

giustapposizione di moduli elementari, altamente conservati dal punto di vista evolutivo, la cui miscelazione

caratterizza la catena A degli enzimi. Tale variabilità controllata serve per adattare l’enzima a recettori di

varia natura e per adattarli al substrato dell’attività enzimatica. La catena B è sovrapponibile ad un modulo

elementare, è molto conservata in tutte le serino proteasi e contiene il sito catalitico dell’enzima. La cascata

della coagulazione può avvenire per via intrinseca o via estrinseca queste poi convergono nella via comune

che porta alla formazione del reticolo di fibrina.

La via intrinseca è innescata dall’attivazione spontanea del fattore XII o fattore di Hageman, che si verifica

quando il sangue entra a contatto con la MEC, in particolare con il collagene, oppure con superfici estranee,

il fattore XIIa attiva la PK che diventa callicreina, che amplifica l’attivazione del fattore XII, il fattore XIIa attiva

anche il fattore XI, il quale fattore XIa attiva il fattore IX, che insieme al Ca, al fattore VIIIa e ai fosfolipidi

forma il complesso tenasico, che diventa fattore IXa, che attiva il fattore X tramite il calcio, il fattore VIIIa e i

fosfolipidi, si ha il fattore X attivato. Si parla di sistema plasmatico attivabile da contatto o SPAC.

La via estrinseca comincia con l’attivazione del fattore VII, fattore trombinico, permette il legame con il calcio

e le superfici fosfolipidiche dove si svolge il processo coagulativo, che unito al fattore tissutale o

tromboplastina tissutale attiva il fattore X. Inoltre il fattore VIIa attiva il IX, crossover con la via intrinseca. Il

VIIa ed il Xa possono attivare ulteriormente il fattore VII legato al TF.

La via comune comincia con la formazione di un complesso tra fattore X attivato, calcio, fosfolipidi e fattore

V attivato, il quale viene attivato da piccole quantità di trombina, il fattore Va adatta sui fosfolipidi di

membrana il fattore Xa accelerando la reazione. Il Xa viene ancorato ai fosfolipidi dagli ioni Ca, ed insieme al

Va, il Ca e i fosfolipidi formano il complesso protrombinasico, che attiva il fattore II, cioè la protrombina, che

viene tagliato e diventa trombina o IIa, che trasforma il fibrinogeno in monomeri di fibrina, mattone di

costruzione del polimero finale. Il fibrinogeno è composto da 3 catene, arrangiate come eterodimero: A –

alfa2 – B – beta2 – gamma2. La conversione del fibrinogeno a monomero di fibrina alfa 2 – beta 2 – gamma

2, richiede il taglio del legame peptidico che rilascia il fibrinopeptide A o FPA ed il FPB. Si ha inizialmente

l’organizzazione in domini del fibrinogeno e monomero di fibrina, dominio D, E e punto di distacco FPA e FPB,

quindi si ha la formazione del monomero di fibrina e poi il polimero di fibrina stabile con il fattore XIII attivato

che catalizza il legame covalente tra monomeri di fibrina.

I meccanismi di controllo della coagulazione sono indispensabili per evitare che il sangue coaguli

spontaneamente e per impedire eccessi coagulativi sproporzionati rispetto alla lesione vascolare. 1 ml di

sangue è potenzialmente capace di indurre in 15 secondi la coagulazione di tutto il sangue. I meccanismi

principali di controllo sotto il flusso sanguigno, con azione diluente sui fattori attivati, l’inattivazione delle

proteasi e dei cofattori da parte di inibitori fisiologici, come l’antitrombina III o ATIII, un cui deficit provoca la

trombosi, la proteina C ed S un cui deficit provoca trombosi, il TFPI C1 inattivatore il cui deficit provoca

angioedema, alfa2 – macroglobulina, un cui deficit provoca predisposizione tromboembolica e la demolizione

dei prodotti della coagulazione si ha tramite l’attivazione del sistema fibrinolitico.

L’antitrombina, sintetizzata nel fegato, con emivita di 36 – 60 ore, che appartiene alla famiglia delle serpine

come inibitore delle serin proteasi rappresenta circa il 75% del potere anticoagulante del plasma, si lega alla

trombina tramite il centro reattivo dell’inibitore e il complesso è rapidamente allontanato dal plasma, in

presenza di eparina la velocità di legame trombina ATIII aumenta di 2000 volte.

La proteina C è una glicoproteina vitamina K dipendente, sintetizzata nel fegato e in forma nativa è inattiva,

la sua attivazione avviene a opera della trombina, e viene accelerata dal legame della trombina al recettore

endoteliale trombomodulina, la proteina C attivata o APC degrada i fattori Va e VIIIa della coagulazione. La

proteina S a sin