Patologia clinica

Patologia clinica

La medicina di laboratorio è definita dal Royal College of Pathologists del Regno Unito come “la scienza nascosta che salva le vite”.

La Medicina di Laboratorio è una disciplina tanto nobile e fondamentale nella moderna medicina, quanto ancora debole, perché scarsamente visibile. Il paziente non comprende la centralità dell’informazione di laboratorio perché ancora oggi il rapporto tra paziente e specialista di laboratorio è mediato dal clinico che richiede, interpreta e poi utilizza i dati di laboratorio.

La Medicina di Laboratorio è quella disciplina che studia in campioni biologici provenienti dall’uomo parametri fisici, chimici e biologici che possono fornire informazioni su processi fisiologici e/o patologici che avvengono nell’uomo stesso a vari livelli d’organizzazione strutturale:

• A livello di sistemi
• A livello di organi
• A livello di tessuti
• A livello di cellule
• A livello di singole molecole – (DNA, proteine)

L’esame di laboratorio

• Richiesto dal medico per la valutazione, cura e prevenzione dello stato di malattia. Insieme ad altri dati (strumentali, anamnesi), coadiuva il clinico nella scelta di una decisione, sia essa un approfondimento diagnostico, oppure una modifica terapeutica.
• Serve per confermare un sospetto clinico, per stabilire o escludere una diagnosi, per monitorare la terapia, per formulare una prognosi, per lo screening di una patologia in soggetti apparentemente sani.
• È un procedimento qualitativo, semiquantitativo, o quantitativo inteso a evidenziare la presenza o a misurare la quantità di un costituente biochimico in un materiale biologico.

Materiali biologici su cui eseguire l’esame

• Sangue
• Urina
• Liquor
• Liquido seminale
• Liquido amniotico
• Feci
• Escreato
• Succo gastrico e duodenale
• Sudore
• Frammenti di tessuto bioptici

Sostanze misurabili nel siero

Un esame di laboratorio comprende una serie ordinata di passaggi:

Fase preanalitica →

1. Richiesta dell'esame
2. Preparazione del paziente
3. Raccolta del campione

Fase analitica vera e propria →

4. Esecuzione dell’esame
5. Controllo di qualità

Fase post-analitica, interpretativa →

6. Compatibilità dei dati ottenuti con il sospetto clinico
7. Referto

Brain to brain loop

È un modello che esplicita i passaggi che compongono il ciclo dell'esame di laboratorio. Tutto nasce da una DOMANDA, dall'esigenza del clinico (spesso anche del paziente stesso) di richiedere un esame laboratorio per superare i limiti della semeiotica tradizionale e comprendere la condizione di salute a 360°.

Perché si richiede un esame di laboratorio?

• Per confermare un sospetto clinico
• Per stabilire o escludere una diagnosi
• Per monitorare la terapia
• Per monitorare i livelli terapeutici di un farmaco
• Per formulare una prognosi
• Per lo screening di una malattia tra persone apparentemente sane
• Per definire l'estensione o la gravità di una malattia

Biomarker rilevati

A livello genomico → a livello proteomico → a livello metabolico →

Il laboratorio non fa attività clinica, ma fornisce al medico curante su richiesta mezzi per l'atto clinico.

Preparazione del paziente – fattori che influenzano i dati in laboratorio

CPK: Cheratinfosofchinasi; AST: Alanina amino transferasi (stato di salute epatico).

In generale, escludendo gravi patologie come l’INFARTO o le malattie polmonari, il Creatinfosfochinasi (CPK) alto può indicare il grado di affaticamento muscolare: quando il suo valore, che raggiunge il massimo quindici ore dopo lo sforzo, è superiore a 300 mU/ml di sangue, è necessario riposo.

Per esempio, se ci si strappa il muscolo di una gamba mentre si corre, o semplicemente se ci si lesiona il muscolo del cuore durante un infarto, le cellule muscolari o le cellule cardiache che hanno subìto un danno rilasciano la CPK: nel giro di quattro o sei ore dall’evento si può rilevare un incremento dell’attività di questo enzima, che raggiunge il valore massimo dopo circa 15 ore e infine, in tre o quattro giorni torna normale.

Effetto dell’età

Con l’età: differente assetto biochimico + aumento incidenza di patologie. →

• Nell’anziano aumentano: Ca ionizzato, glucosio, insulina, LH, FSH, TSH, TG, GT, urea, IgA, LDL
• Nell’anziano diminuiscono: fosfato, testosterone (M), estriolo e estradiolo (F), T3, T4, IgM, IgD, Zn, Fe, Hb, G.R, leucociti

Farmaci e droghe

La somministrazione di qualsiasi farmaco è in grado di modificare i parametri emato-chimici.

• Intossicazione acuta o cronica da alcool = aumento livelli lattato, urato e GGT (Gamma glutamil transpeptidasi)
• Effetti cronici del fumo = aumento Hb, maggiore MCV (VOLUME CORPUSCOLARE MEDIO), aumento leucociti

Interferenze endogene: emolisi

L’emolisi è causa di errore per il passaggio di emoglobina e di altre sostanze dagli eritrociti al siero (o plasma).

• L’emoglobina può interferire con metodi di dosaggio colorimetrici (assorbimento a diverse lunghezze d’onda) e inibire alcune reazioni chimiche.
• Le sostanze la cui concentrazione eritrocitaria è maggiore di quella del plasma, misurate nel siero/plasma, risultano sopravvalutate.

Materiali biologici

Gli esami di laboratorio si eseguono su campioni biologici raccolti nel paziente secondo diverse modalità.

I materiali biologici sui quali sono effettuati esami di laboratorio sono i seguenti:

• Sangue intero, plasma o siero che possono essere ottenuti da vene, arterie o capillari (prelievo)
• Urine (raccolta diretta da parte del paziente)
• Feci (raccolta diretta da parte del paziente)
• Liquido cerebro-spinale (rachicentesi)
• Liquido peritoneale (paracentesi)
• Liquido pleurico (paracentesi)
• Liquido pericardico (paracentesi)
• Liquido sinoviale (artrocentesi)
• Liquido amniotico (amniocentesi)
• Liquido seminale
• Latte materno
• Saliva (raccolta diretta da parte del paziente)
• Sudore
• Capelli
• Tessuti solidi (biopsia)
• Midollo osseo (prelievo o biopsia midollare)
• Calcolo
• Secreto bronchiale (Aspirato/Lavaggio tracheo-bronchiale o bronco alveolare)
• Succo gastrico
• Secreti: faringeo, nasale, auricolare, uretrale, vaginale, da ferita, da drenaggi.

Su ognuno di questi materiali possono essere dosate varie sostanze che sono indicate col nome di ANALITI (più di un centinaio dosati in un moderno lab!).

Oltre alla sostanza dosata e al materiale biologico le altre peculiarità che caratterizzano un esame di laboratorio e che sono indicate sul referto sono:

• Unità di misura
• Il risultato
• Valori di riferimento

Raccolta di sangue

Il sangue

• Il sangue è un tessuto connettivo allo stato fluido circolante all’interno dei vasi sanguigni.
• Il sangue trasporta ossigeno e nutrienti, elimina i rifiuti, mantiene la temperatura corporea, regola l’equilibrio idrico e acido-base, difende l’organismo da virus, batteri e altri agenti estranei e ripara le lesioni.

Costituisce circa l’8% del peso corporeo e il suo volume dipende dall’età, dal sesso e dal peso di un individuo. In un uomo adulto il volume totale di sangue è di 6-7 litri (NORMOVOLEMIA).

Variazioni maggiori del volume fisiologico →

IPERVOLEMIA:

IPOVOLEMIA: variazioni minori del volume fisiologico →

È composto da una PARTE CORPUSCOLARE formata da globuli rossi, globuli bianchi e piastrine, che rappresenta circa il 45% del totale, e da una LIQUIDA detta PLASMA, pari al 55% del totale.

Da un prelievo di un campione di sangue con anticoagulanti (EDTA, ossalato di potassio, citrato di sodio) si separano per centrifugazione tre fasi:

• Plasma
• Leucociti e piastrine (buoy coat)
• Eritrociti (o emazie che sedimentano sul fondo)

È definito EMATOCRITO la percentuale in volume occupata dagli elementi corpuscolari (in generale si riferisce ai GR: VOLUME DEI GR SEDIMENTATI RISPETTO AL VOLUME EMATICO TOTALE) rispetto al volume complessivo del sangue.

Tale valore è in media del 45%. (uomini:39-49% - donne:33-43%) I GR rappresentano più del 99% degli elementi figurati. I GB e le piastrine occupano meno dell’1% del volume totale e nella provetta formano un anello sottile detto buoy-coat.

Plasma

È un liquido di color giallo chiaro costituito per il 90% da acqua, per il 10% da sostanze organiche e sali disciolti. Le proteine maggiormente rappresentate (60% del totale) sono le albumine che contribuiscono a determinare una corretta pressione osmotica del sangue, impedendo un eccessivo passaggio di acqua dal torrente circolatorio ai tessuti.

Numerose le globuline (35% del totale), di cui fanno parte:

• Alfa globuline con funzioni di trasporto (aptoglobina, alfa2globina che lega Hb libera e ne impedisce l’escrezione nell’urina)
• Beta globuline es. il plasminogeno (idrolizza la fibrina dei trombi), la transferrina (trasporta il ferro), il fibrinogeno (5% del totale), la forma inattiva della fibrina, fondamentale per la costituzione dei coaguli)
• Gamma globuline dette immunoglobuline o anticorpi con funzione di difesa. Esistono 5 classi di immunoglobuline: IgA, IgM, IgE, IgD e IgG.

Il plasma contiene anche glucidi, principalmente sotto forma di glucosio, lipidi quali i trigliceridi e i fosfolipidi, e numerosi ioni, magnesio, sodio, potassio, cloruro, calcio, acido urico, urea e altri cataboliti.

Siero

È plasma de-fribinato, cioè privo dei fattori di coagulazione.

Plasma e siero contengono tracce di qualunque sostanza prodotta o penetrata nell’organismo (porzioni troncate di recettori, acidi nucleici, ecc) e quindi sono la principale sorgente di campioni per la Medicina di Laboratorio.

Prelievo di sangue

Sangue intero

Un campione di sangue venoso, arterioso o capillare nel quale le concentrazioni e le proprietà dei costituenti cellulari ed extra cellulari devono rimanere inalterate rispetto allo stato in vivo per un certo periodo di tempo (effetto stabilizzante degli anticoagulanti).

Prelievo venoso, capillare o arterioso →

• Analisi chimico-cliniche di routine: sangue venoso e capillare (dito, lobo, tallone)
• Studio equilibrio acido-base: sangue arterioso

Prelievo di sangue

Assicurarsi che sia disponibile tutto il materiale per il prelievo ovvero cotone, laccio, sistema per provette sottovuoto (ago a doppia punta o ago Butterfly, camicia, provette), contenitori per l'eliminazione del materiale usato per il prelievo, supporti per provette.

Raccolta di sangue

Colore dei tappi

• Rosso: senza aggiunte di anticoagulanti, per ottenere il siero
• Giallo: tubo sterile (senza anticoagulanti), ma con gel SST (serum separating tubes)
• Lavanda: EDTA (complessa Ca⁺⁺, per conta degli eritrociti)
• Grigio: ossalato (complessa Ca⁺⁺), fluoruro e iodoacetato (inibitori della glicolisi), per glicemia
• Verde: eparina (proteoglicano, accelera l'azione di antitrombina III)
• Verde chiaro: ioni del plasma
• Nero: per siero, con gel separatore (densità intermedia fra eritrociti e plasma)
• Blu: citrato (complessa Ca⁺⁺ reversibilmente), per fattori della coagulazione
• Blu scuro: (eparina + EDTA), per elementi in traccia

Tipi di provette

Anticoagulanti

• Additivi che inibiscono la coagulazione del sangue senza interferire sulla misura degli analiti
• L’inibizione della coagulazione avviene per legame degli ioni calcio (EDTA, citrato) o per inibizione dell’attività della trombina (eparinati)
• I tipi e le concentrazioni di anticoagulanti usati nei campioni di sangue venoso sono stati definiti secondo standard internazionali (nel 1996).

L'anticoagulante usato per sangue o plasma non deve interferire direttamente o indirettamente nell'analisi.

Eparina

• Anticoagulante “naturale”
• È un mucoitinpolifosfato
• Salificata con Na, K, ammonio o litio
• Attività antitrombinica (blocca la formazione di trombina e quindi di fibrina dal fibrinogeno)
• Sconsigliata in indagini ematologiche morfologiche
• 10-20 u.1./ml (0.2 mg/ml)

Ossolato

• Sali di Na, K, ammonio o litio
• Forma complessi poco solubili con gli ioni calcio
• Usato per analisi di coagulazione
• Sconsigliato il sale di potassio a conc. > 3 mg/ml (emolisi!)
• 1-2 mg/ml

EDTA

• È l'acido etilendiamminotetraacetico
• Sale bi-o tri-potassico (più solubile) e bisodico
• Forma complessi con gli ioni calcio (è un agente chelante)
• Ottimo in esami ematologici (non altera le componenti cellulari)
• 1.5-2 mg/ml (soluzione 0.1% essiccata in provetta miscelato con sangue nel rapporto opportuno)

Citrato

• Sale sodico
• Forma complessi con gli ioni calcio
• Anticoagulante di scelta in ematologia per studi sulla coagulazione e per determinare la VES (usato raramente in ematochimica)
• Soluzione alla concentrazione di 3.4-3.8 g/dl miscelato con sangue nel rapporto volumetrico 1:10.

Fluoruro

• Sale di K (più solubile)
• Forma complessi con gli ioni calcio
• Anticoagulante usato come glicostatico (2 mg/ml) (inibisce gli enzimi della glicolisi), accoppiato con EDTA
• 2 mg/ml (soluzione 0.1% essiccata in provetta miscelato con sangue nel rapporto opportuno).

Trasporto e consegna alla fase analitica

Una volta eseguito il prelievo, il campione trattato in modo adeguato (temperatura controllata - intorno ai 10°C -, eventuale uso stabilizzanti o conservanti) deve essere spedito in laboratorio in tempi brevi.

Pervenuto in laboratorio, l’addetto all’accettazione deve verificare se sono state rispettate tutte le misure previste nella manipolazione del campione (validazione tecnica prelievo-idoneità). Registrazione dei contenitori e del nominativo del paziente.

Separazione plasma – siero

Verifica veloce quale è la differenza nel contenuto di componenti proteiche tra plasma e siero?

Il plasma o il siero dovrebbero essere separati dalle cellule il prima possibile e sicuramente entro 2 ore per evitare emolisi.

• La SEPARAZIONE deve essere RAPIDA, MA NON TROPPO
• La separazione prematura del siero può causare la formazione continuata di fibrina

La coagulazione di solito si completa entro 20-30 min in provette di vetro, più lenta in provette di plastica.

• Dopo la separazione, il campione viene smistato secondo le analisi richieste.

ATTENZIONE alla possibile presenza di sostanze interferenti nelle determinazioni analitiche (bilirubina, lipidi)!!!

Conservazione dei campioni biologici

Stabilità

La composizione del campione non deve variare rispetto alla composizione esistente in vivo al momento del prelievo. Assicurare mantenimento in vitro della concentrazione e dell’attività di tutti i costituenti plasmatici e cellulari del sangue.

• Le analisi su plasma e/o siero devono essere eseguite entro 4 ore dal prelievo se il campione viene mantenuto a temperatura ambiente, altrimenti il campione può essere conservato a 4°C per 24 ore senza subire particolari variazioni.
• Per ormoni e metaboliti come l’ammonio occorre tenere il campione in acqua e ghiaccio ed eseguire la misura nel minor tempo possibile, altrimenti congelare a -20°C o a -80°C.

Processi specifici coinvolti nell’alterazione della conservazione

1. Chimici fisici
   Evaporazione, Solubilità, Adsorbimento, Desorbimento, Diffusione, Fotolisi, Denaturazione, Polimerizzazione, Aggregazione
2. Biochimici o biometabolici
   Alterazione dei sistemi energetici, Alterazione dei gradienti di concentrazione, Alterazione della permeabilità cellulare, Alterazione della concentrazione dei metaboliti

Raccolta urine

• Recipiente di raccolta assolutamente pulito e, in caso di urinocoltura, anche sterile →
• Campione prima minzione mattutina →
• Urine 24 ore alcuni parametri biochimici subiscono variazioni cronobiologiche – scartare prima minzione e raccogliere in unico recipiente (conservato a freddo) tutte le urine emesse nelle 24 ore →

Prelievo liquido amniotico

Il liquido amniotico (amniocentesi).

• È utilizzato per:
  • Controllare maturità e funzionalità di organi e apparati fetali
  • Rilevare eventuali malformazioni (es. sistema nervoso)
  • Diagnosticare precocemente malattie genetiche
• È effettuato tra la 15° e la 19° settimana - Prelievo eseguito mediate puntura transaddominale del sacco amniotico e aspirazione in siringa
• È di aspetto lievemente opalescente e di colore giallo citrino molto tenue, in condizioni normali. Si presenta contaminato da sangue materno per la rottura di qualche vaso durante la penetrazione dell’ago
• Di norma non si usano anticoagulanti

Prelievo liquido cefaloradichiano (LCR) (rachicentesi)

• Chiamato anche LIQUOR, è un fluido corporeo che si trova negli spazi lasciati vuoti dall’encefalo e dal midollo spinale all’interno della dura madre (160 ml nell’adulto, 40-60 ml nel neonato)
• La sede del prelievo è in colonna, tra la 4° e la 5° vertebra lombare
• Si presenta incolore e limpido (altrimenti contaminato da sangue del prelievo)
• Consigliabile un prelievo di 3-4 ml, da tenere a temperatura ambiente e da analizzare entro un’ora
• Il liquor cerebrospinale può essere analizzato per eseguire la diagnosi di una grande varietà di malattie neurologiche (meningiti, sclerosi multipla, ecc.)

Permette anche di iniettare farmaci direttamente all’interno dello spazio sub aracnoideo e ridurre la pressione intracranica in caso di idrocefalo (accumulo di liquor nei ventricoli cerebrali che si dil