Patologia clinica

Patologia clinica

Medicina di laboratorio

Prof. Caponi

La medicina di laboratorio studia parametri chimici e citologici che possono fornire informazioni per processi fisiologici e patologici in campioni biologici. Testo: elementi di biochimica clinica e medicina di laboratorio Ciaccio Edises.

Processo brain-to-brain loop

Esame di laboratorio richiesto dal clinico curante, tecnico ed esami diagnostici richiesti, analisi risultato referto clinico e paziente.

Richiesta esami di laboratorio

• Prevenzione: valutazione stato di salute (stato generale di salute e valutazione soggetti a rischio con operazioni di screening in soggetti apparentemente sani, es. sangue occulto per cancro colon retto, valutazione assetto lipidico per malattie cardiovascolari).
• Diagnosi diretta o differenziale: indici diagnostici (la cui positività/anormalità è necessaria e sufficiente per diagnosi) o esami che coadiuvano la diagnosi (utile per diagnosi differenziale, cioè per restringere il campo delle possibili diagnosi).
• Prognosi e monitoraggio: valutazione evoluzione malattia; alcuni parametri si alterano in misura proporzionale alla gravità della patologia o all'entità del danno, altri consentono di prevedere andamento malattia. Per monitorare la malattia usiamo parametri che si normalizzano con guarigione oppure si modificano in base ad andamento della patologia (es. anticorpi dopo infezione). Altri parametri vengono monitorati per tenere sotto controllo andamento patologia cronica.
• Terapia:
  • Indagini per identificazione causa patologia (es. UTI).
  • Monitoraggio terapia cronica (es. terapia anticoagulante).
  • Valutazione effetti collaterali per cessare terapia, modificare protocollo, cambiare farmaco.

Il dato di laboratorio può fornire le basi della comprensione di alcune manifestazioni patologiche (es. petecchie-piastrinopenia; ittero-bilirubina; edemi periferici-albumina).

Fattori che influenzano il dato di laboratorio

(Oltre alla malattia)

Variabili preanalitiche

• Preparazione del paziente: cerca di limitare effetti dei fattori controllabili sul risultato
  • Variabilità biologica
    • Età (non controllabile) – ogni età ha potenzialmente i suoi range di riferimento [Es. nei bambini, parametri di risposta immunitaria sono diversi, ALP più elevata. In anziani, diminuzione funzionalità renale fisiologica, variazioni livelli alcuni ormoni, aumenta fisiologicamente colesterolo totale].
    • Sesso (non controllabile; differenze analitiche compaiono dopo pubertà) – riflettono asse ormonale, massa muscolare, altre cause non immediatamente identificabili [es. uricemia – acido urico, col HDL, transaminasi].
    • Fattori fisiologici NON controllabili
      • Variazioni periodiche intrinseche degli analiti [es. ormoni sessuali] – circadiane [es. cortisolo].
    • Fattori fisiologici e non fisiologici controllabili
      • Dieta quantità e qualità, relazione con prelievo campione, vegetarianismo/veganismo, caffeina, fibre.
      • Esercizio fisico es. soggetti non allenati – esercizio fisico intenso (enzimi muscolari, proteinuria); esercizio costante – miglioramento assetto lipidico.
      • Postura volume circolante di sangue circa 5 litri. Volume circolante è minore in ortostatismo (-600ml) rispetto alla posizione clinostatica (posizione distesa). Variazioni avvengono in tempi di 10-30 minuti.
      • Farmaci Es. diuretici (ipopotassiemia), induttori epatici (influenzano biosintesi delle proteine e causano aumento fibrinogeno, GGT, fattori coagulazione), anticoagulanti/antiaggreganti (prima o antiaggreganti come effetto 2° [es. FANS]).
      • Alcool se dose moderata effetti trascurabili. Se assunzione cronica aldeide acetica come intermedio del metabolismo = sofferenza epatica.
      • Fumo assetto lipidico meno favorevole, Hct più elevato per > CO-Hb.
    • Parametri ambientali Es. elevate altitudini aumento Hb.
• Gestione del paziente prima del test = ricerca delle condizioni basali:
  • Al mattino
  • Paziente a digiuno da 8-12h
  • Paziente a riposo
  • Paziente seduto o supino
• Condizioni del campione:
  • Raccolta:
    • Tipologia di campione – es. anticoagulante o siero
    • Anticoagulanti = sostanze che impediscono coagulazione.
    • Necessari per analisi componenti corpuscolate sangue e componenti plasmatiche
    • Chelanti del calcio legano il calcio necessario per attivazione coagulazione. Citrato e EDTA.
    • Citrato anticoagulante d'elezione per valutazione coagulazione. Chelante REVERSIBILE del calcio. No preservazione componente cellulare (in casi di piastrinopenie si possono richiedere campioni in citrato per verificare conta piastrinica). Anticoagulante liquido al 3.8% in provetta.
    • EDTA chelante IRREVERSIBILE del calcio. Indicato per CBC, conservazione cellulare ottima. Non per dosaggio elettroliti.
    • Eparina cofattore dell'antitrombina III (litioeparina). Indicato per analisi di chimica clinica, NO morfologia cellulare e dosaggio dei sali contenuti nell'anticoagulante (Es. Litio).
    • Identificazione: modalità “resistente”
    • Correttezza dati richiesta/foglio accompagnamento
    • Raccolta accurata (centro prelievi/struttura ospedaliera vs. casalinga).
  • Campioni diversi dal sangue:
    • URINE campione del primo mattino +++, talvolta richiesto campione urine 24h per dosaggio di analiti escreti in modo variabile (talvolta richiesto additivo). Campione sterile per urinocoltura.
    • FECI sangue occulto, esame colturale, parassitologico.
    • Liquor WBC, Ig ed esami colturali.
    • Liquido sinoviale WBC, mucina e cristalli.
    • Saliva IgA salivari.
  • Trasporto:
    • Modalità ideali = tempi brevi, temperature adeguate, evitando stress meccanici, appositi contenitori
    • Verifica dell'accettabilità e idoneità:
      • Identificazione assente o incompleta
      • Contenitore non integro
      • Quantità insufficiente
      • Prelievo in anticoagulante sbagliato
      • Rapporto sangue-anticoagulante non corretto
      • Emolisi evidente
      • Presenza di coaguli
  • Processazione e conservazione:
    • Separazione plasma o siero – centrifugazione in tempi brevi. Se analisi non può essere effettuata immediatamente stoccaggio (4°C oppure congelato a -20/-80°C, dipende da analita)

Variabili analitiche

• Scelta del metodo
• Bontà dell'esecuzione

Qualità del dato di laboratorio

Compito del laboratorio = risultati attendibili. L'attendibilità dipende da:

• Metodo
  • Sensibilità = minima quantità della sostanza da analizzare dosabile in quel campione
  • Specificità = capacità del metodo di dosare solo la sostanza in esame
  • Accuratezza = concordanza tra valore misurato e valore reale dell'analita
• Efficienza analitica
  • Precisione = concordanza dei risultati di più determinazioni eseguite sullo stesso campione

Errori di laboratorio

Differenza fra risultato uscito dal laboratorio e il valore “vero”

• Errori grossolani – errori di trascrizione
• Errori sistematici – legati a metodi poco specifici
• Errori casuali – Es. errori legati alla manualità

Controlli di qualità – controllare se variazioni dell'esecuzione degli esami rientrano nei limiti accettabili = monitoraggio di precisione e accuratezza. Esistono CC interlaboratori e intralaboratori.

Concetti di efficacia, efficienza e appropriatezza

• Efficacia = capacità di raggiungere l'obiettivo proposto
• Efficienza = raggiungimento obiettivo con il dispendio minimo di mezzi ed energie
• Appropriatezza = richiesta da parte del medico dell'esame che dà più informazioni cliniche/diagnostico/terapeutiche su quel paziente

Ematologia

Studia cellule del sangue dal punto di vista quantitativo e qualitativo – RBC, WBC, PLT – studio precursori del midollo – studio analiti connessi all'emopoiesi – studio coagulazione.

Emocromo (= emocromocitometrico) parametri forniti dal contatore automatico – conta RBC, WBC, PLT + HGB e volume globulare RBC + indici eritrocitari calcolati + valutazione diverse popolazioni WBC.

Valutazioni a carico dell'operatore:

• Striscio di sangue con colorazione May-Grunwald-Geimsa
• Valutazione morfologica

May Grunwald-Geimsa = May Grunwald concentrato (eosinato blu di metilene + metanolo)

1. Soluzione May Grunwald concentrata a coprire vetrino per 3' [FISSAZIONE]
2. Aggiunta acqua bidistillata in proporzione 1:1 per 5' [COLORAZIONE 1]
3. Scarto liquido in eccesso
4. Geimsa (eosina giallastra, blu di metilene, Azur A e B e violetto di metilene) al 10% per 10' [COLORAZIONE 2]
5. Risciacquo con abbondante acqua distillata/acqua di fonte
6. Asciugatura all'aria

Lettura a 100x a immersione

Globuli rossi (= eritrociti)

• Elementi cellulari anucleati che perdono in nucleo nell'ultima fase maturativa
• Dimensioni 7-8um
• Contengono Hbg e trasportano O2 ai tessuti
• Valori di riferimento: dipendente dal sesso [4,3-5,8 M/uL uomo vs 4-5,2 M/uL donna]
• Volume globulare medio RBC stimato direttamente (foreward scatter); esprime il valore medio del volume degli RBC circolanti [80-98 fL].
  • Se diminuito – microcitosi
  • Se aumentato – macrocitosi
  • Se distribuzione MCV ampia – anisocitosi RDW
• [red cell distribution width] distribuzione del volume degli RBC [12-15%]
• [ematocrito] = volume occupato dalla parte corpuscolata del sangue = massa eritrocitaria. Dipendente dal sesso – [40-50% uomo vs. 36-46% donna]. Calcolato in base a numero di RBC e MCV. Una sua diminuzione si associa ad alcune forme di anemia.
• [emoglobina] costituta da 4 subunità proteiche + gruppo EME (non proteico con Fe) con ruolo di trasportatore di O2 ai tessuti. Nei capillari polmonari l'HB è saturata al 95%.
  • Si parla di metaemoglobina quando HB ha Fe, non più in grado di legare ossigeno.
  • Carbossiemoglobina (HbCO) – Hb alla quale si lega il monossido di carbonio al posto dell'O2.
  • Misurata lisando i RBC con conversione a cianometaemoglobina e letta con spettrofotometro (540-546nm).
  • Dipendente da sesso – 13,5-17,5 g/dL uomo vs 11,5-15,5 g/dL donna
  • Anemia = DIMINUZIONE EMOGLOBINA
• [mean cell Hb] = contenuto cellulare medio di Hb.
  • Calcolato come rapporto fra Hb e numero di RBC
  • Range 27-33 pg
• [mean cell Hb concentration] = concentrazione cellulare media di Hb
  • Calcolato come rapporto fra Hb e HCT
  • Range 33-36 g/dL
  • MCH e MCHC ci dicono quanto l'Hb riempie il RBC:
    • Normocromia = normale colorazione di RBC = MCH e MCHC nei range
    • Ipocromia = diminuzione contenuto emoglobinico aumenta area pallida RBC e variazione MCH e MCHC
    • Ipercromia = condizione molto rara in soggetti con sferocitosi con alterazione del citoscheletro RBC con perdita biconcavità.
• Reticolociti = giovani RBC con ribosomi all'interno. Colorazioni specifiche. Range di normalità 0,5-1,5%. Parametro di risposta midollare. Misurati utilizzando fluorocromi che si legano agli acidi nucleici presenti:
  • LFR (low fluorescence ratio) – reticolociti maturi [78-92%]
  • MFR (medium fluorescence ratio) – reticolociti con caratteristiche maturative intermedia [6-18%]
  • HFR (high fluorescence ratio) – reticolociti immaturi [0-4%]
  • Se aumentati – risposta normale a perdita di massa eritrocitaria perduta per aumentata richiesta al midollo.

Leucociti (WBC)

Valutati dopo lisi RBC. ↑=leucocitosi; ↓=leucopenia. Il contaglobuli li differenzia usando diversi parametri volume cellulare, granularità, caratteristiche biochimiche. Range RI [4.000-10.000/uL].

• Neutrofili: nome derivante da forma nucleare, fagociti contenenti enzimi con funzione digestiva di materiali estranei, fagociti ad azione immediata, dopo la fagocitosi degenerazione e morte. 40-70% dei WBC. ↑ in infiammazione = neutrofilia; se ↓ neutropenia.
• Eosinofili: granuli intracitosplamatici color rosso aranciato. RI 0-5%. ↑ in allergie e parassitosi = eosinofilia.
• Basofili: granuli intracitoplasmatici bluastro scuro, che talvolta non permette di vedere nucleo. Simili ai mastociti. RI 0-1% WBC. ↑ in patologie ematologiche midollari= basofilia.
• Linfociti: effettrici del sistema immunitario. Con elevato rapporto N/C. RI 19-48%. I vari tipi di linfociti (T, B e NK) coesistono in circolo e sono praticamente indistinguibili.
• Monociti: con abbondante citoplasma. Molti granuli di piccole dimensioni conferiscono l'aspetto a "vetro smerigliato" al citoplasma. Attività fagocitica dopo differenziazione macrofagica in cui modificano forma e funzionalità. RI 3-9%.

Piastrine (= trombociti)

• Frammenti cellulari derivanti dagli pseudopodi dei megacariociti.
• Dimensioni 2-5um, volume [MPV] 6-12 uL. Vita media piastrine 15 giorni. Primo presidio emostasi. RI 150.000-350.000/uL.

Alterazioni a carico degli RBC

Anemia = diminuita concentrazione di Hb.

• Classificazione patogenetica:
  • MCH/MCHC – normo/ipocromica
  • MCV – Normocitica
  • Clinica dell'anemia condizionate da:
    • Entità anemia
    • Velocità con la quale si instaura
    • Misure di compenso dell'organismo. Sintomi comuni= affaticabilità, dispnea da sforzo, tachicardia, pallore.
• Anemia da ridotta produzione di Hb = anemie microcitiche ipocromiche
  • Anemia sideropenica o da carenza di ferro
    • Fe=elemento essenziale implicato nel trasporto dell'ossigeno (in RBC, mioglobina e in alcuni enzimi). Introdotto con dieta (Fe++ emico=carne 10-15% ma facilmente assorbibile; Fe+++ ferro inorganico= legumi, verdure). A livello dell'enterocita – recettori per assorbimento di Fe non eme = trasportatore di metalli divalente [DMT] e per il Fe eme = HCP1 [Heme carrier protein 1].
    • Se destinato ad emopoiesi direttamente ferroportina lo fa uscire e lo cede alla transferrina [= trasportatore proteico specifico per veicolare il Fe ai tessuti; globulina sintetizzata dal fegato; lega 2 atomi di Fe, che satura circa 1/3 della transferrina; veicola in Fe e lo cede alle cellule che dispongono dello specifico recettore di membrana]
    • Se non c'è immediato bisogno incorporazione in molecole di ferritina [= proteina che immagazzina il ferro non immediatamente utilizzato in fegato e in cellule del sistema reticolo endoteliale; proteina di grandi dimensioni che racchiude un "core" di Fe sottoforma di ossido-idrossido di Fe; prodotta principalmente dal fegato].
    • Il Fe non ha un sistema di eliminazione dedicato e viene eliminato tramite gli epiteli in cui si accumula (intestino, cute) e perdita di sangue mestruale.
  • Causa stato di carenza:
    • Aumentate esigenze – fase di accrescimento, donne in gravidanza
    • Per eccessive perdite – sanguinamento cronico [mestruo, patologie app. dig benigne e maligne].
  • Aspetti clinico-patologici: Diminuita Hb + Microcitosi + Ipocromia. Solo ultima manifestazione di una carenza di Fe.
  • Esami per accertare anemia sideropenica:
    • Sideremia – variabile molto variabile. Diminuito anche in altre patologie (es. patologie infiammatorie croniche)
    • Transferrina [Nefelometro o turbidimetro, entrambe le metodiche si basano su anticorpi anti-analita. Nel turbidimetro si misura la luce intercettata/assorbita dal campione; nel nefelometro si misura la luce deviata/rifratta. Nefelometro + sensibile, soprattutto per analiti presenti in piccole quantità]. Range 200-350 mg/dL. Aumenta in condizioni di sideropenia, anche se diminuisce la saturazione.
    • Ferritina – indica lo stato dei depositi periferici di Fe. Generalmente intracellulare, ma ce ne è una piccola quantità circolante. C'è una relazione fra ferritina circolante e depositi intraepatici di Fe. Range riferimento varia in base a sesso e momento della vita, mediamente più bassi nelle donne. Diminuisce in carenza di Fe, se i depositi sono depauperati. Aumenta per: sovraccarico di Fe (emocromatosi, trasfusioni di sangue frequenti), lesioni a epatociti, infiammazione, marcatore tumorale.
    • Protoporfirine eritrocitarie – una volta incluso in Fe, forma il gruppo eme. Aumentano in caso di carenza di Fe.
    • Recettori solubili della transferrina – derivano dalla distruzione dei recettori sugli eritrociti, quindi aumentano in anemia sideropenica. Ma anche in anemia emolitica.
• Emocromatosi
  • Genetica = aumento sconsiderato di assorbimento di Fe per difetto delle proteine coinvolte nel suo assorbimento e trasporto, a partire dall'enterocita. ++ paesi Nord Europa.
  • Secondaria = trasfusioni ripetute
  • In entrambi i casi – danni nei tessuti e organi dove si accumula fegato, cuore, pancreas (endocrino++), articolazioni.
• Talassemia genetica; anemia da varianti globiniche difetti di produzione quali-quantitativi.