Parassitologia clinica

Parassitologia clinica

Introduzione

Prof. Bruschi: valutare sia mortalità legata alle malattie infettive/parassitarie più perdita della qualità di vita DALY = Disability-adjusted life years! TBC, HIV/AIDS, malaria. Importanti anche altre malattie parassitarie causa di DALY parassiti intestinali (anchilostomi, tricuridi, ascaridi…).

Il soggetto esposto all'infezione può sviluppare o meno malattia infettiva: carica infettante vs. difese ospite. IgA sieriche (monomeri circolanti) e secretorie (dimeri mucosali, non circolanti) – Immunodeficienza comune variabile = incapacità di shift da IgM a IgA = deficit selettivo di IgA + agammaglobulinemia = deficit su tutte le classi anticorpali. Queste patologie sono associate a una maggiore suscettibilità a parassitosi intestinali protozoarie (=malattia più grave).

Associazione biologica

Rapporto biotici intercorrenti tra due specie diverse, animali o vegetali, di cui entrambi o una soltanto può trarre beneficio o danno:

• Simbiosi mutualistica – entrambi benefici
• Commensalismo – convivenza
• Parassitismo – una trae vantaggio a discapito dell’altra.

Si instaura con incontro occasionale e associazione con diversa velocità di adattamento apparente simbiosi parassitismo.

Caratteristiche del parassita

Parassita = organismo che vive su/in un altro organismo appartenente a un’altra specie nutrendosi a sue spese e danneggiandolo (danno variabile in base alla patogenicità dell’organismo).

• Ectoparassiti – vivono su superficie corporea
• Endoparassiti – in organi o cavità naturali

Classificazione del parassita

I parassiti possono essere:

• Facoltativo – capace di vita libera (es. Naegleria – ameba mangiacervello)
• Parassita obbligatorio – vive solo se parassita
• Stazionario – femmine ematofaghe di Anopheles
• Periodici – adulti vermi intestinali (es. Anchilostomi duodenale)
• Permanenti – es. Trichinella
• Monoxeno – ciclo biologico del parassita coinvolge un solo ospite
• Polixeno – ciclo biologico del parassita coinvolge più ospiti

Ospiti e vettori

• Ospite definitivo = dove avviene la fecondazione del parassita
• Ospite intermedio = tutti gli altri ospiti
• Vettori = organismi che trasmettono il parassita (es. flebotomi per Leishmania, Anopheles per malaria)

Legame ospite-parassita

Adattamento trofico e fisiologico - Parassitologia biochimica e molecolare. Adattamento morfologico - Parassitologia morfologica ed ultrastrutturale.

Adattamento immunologico – immunoparassitologia = ricerca di marker di risposta immunologica dell’organismo verso il parassita per fare diagnosi (ricerca di anticorpi o antigeni in liquidi biologici, ricerca dei coproantigeni).

Effetti della risposta immunitaria verso il parassita

• Guarigione completa = il parassita viene eliminato e l’ospite è immune verso nuove infezioni (immunità sterilizzante)
• Guarigione clinica = resistenza alla reinfezione, persistenza del parassita (immunità concomitante, premunizione o immunità non sterilizzante). Caratteristica dei parassiti che colpiscono l’uomo, es. Toxoplasmosi
• Assenza di risposta immune = assenza di resistenza alla reinfezione, persistenza del parassita

Habitat di un parassita

Organo, tessuto, liquido biologico dove si stabilisce il parassita.

Modalità trasmissione protozoi

• Cisti – inalazione/ingestione/vettore – trofozoita in ospite
• Trasmissione diretta interumana (verticale) es. Trichomonas vaginalis
• Cisti – carnivorismo – cisti es. Toxoplasma
• Protozoo sistemico – vettore con forma infettante – protozoo sistemico in ospite (Vector-borne diseases) – malaria, Leishmania

Malaria

Localizzazione = Africa subsahariana+++ (Africa occidentale), Indocina e America del Sud; negli ultimi anni re-incremento delle morti per malaria in seguito a meccanismi di adattamento del parassita/vettore (resistenza a farmaci e insetticidi, modifica del clima e deterioramento dei programmi di controllo).

Bambini <5 anni e donne in gravidanza +++. Più dell'80% dei casi di malaria è sostenuta da Plasmodium falciparum (il più mortale). In Italia, non esiste un vettore ad alta efficienza per far sì che la malaria torni endemica.

Ciclo biologico del Plasmodium spp.

Il ciclo di vita del parassita della malaria coinvolge due ospiti: zanzara infetta e ospite umano. I passaggi principali sono:

• Zanzara infetta fa pasto di sangue
• Sporozoiti infettano epatociti e maturano in schizonti
• Rottura di epatocita e rilascio di merozoiti
• Passaggio a fase eritrocitaria
• Riproduzione asessuata in RBC = schizogonia eritrocitaria
• Merozoiti infettano i globuli rossi
• I trofozoiti a stadio ad anello maturano in schizonti, che si rompono rilasciando merozoiti. Alcuni parassiti si differenziano in stadi eritrocitari sessuali (gametociti)
• I parassiti dello stadio del sangue sono responsabili delle manifestazioni cliniche della malattia. I gametociti, maschili (microgametociti) e femminili (macrogametociti), vengono ingeriti da una zanzara Anopheles durante un pasto di sangue
• Mentre nello stomaco della zanzara, i microgameti penetrano nei macrogameti generando zigoti
• Gli zigoti diventano mobili ed elongati (ookinetes) che invadono la parete dell’intestino medio della zanzara dove si sviluppano in oocisti. Le oocisti crescono, si rompono e rilasciano sporozoiti, che si dirigono verso le ghiandole salivari della zanzara. L'inoculazione degli sporozoiti in un nuovo ospite umano perpetua il ciclo di vita della malaria.

Specie di Plasmodium

• P. falciparum (Africa tropicale, Asia ed America Latina)
• P. vivax (cosmopolita in aree tropicali ed in alcune zone temperate)
• P. ovale (soprattutto in Africa tropicale occidentale)
• P. malariae (cosmopolita, ma con distribuzione molto a macchia di leopardo)

Metodi di rilevamento diretto del parassita

• Esame a fresco (abbandonato; può servire in condizioni estreme)
• Striscio di sangue periferico (dà informazioni sulla specie) – Colorazione con May-Grunwald Giemsa – Limite di sensibilità = 100-300/μl (10 minuti di osservazione)
• Metodo della goccia spessa (permette di rilevare i plasmodi anche in caso di basse parassitemie). Colorazione in Giemsa diluita 1:10-1:20 in H₂O distillata per 30’, quindi delicato risciacquo in H₂O tamponata): all’osservazione con il 100x saranno visibili solo parassiti extracellulari e leucociti. Limite di sensibilità = 10-20 parassiti/μl (10 minuti di osservazione) Procedura del conteggio: N° parassiti contati x 8000 = N° parassiti/μl N° leucociti contati.
• Sierologia = Metodi indiretti – IFA (immunofluorescenza indiretta), IHA (emoagglutinazione indiretta – RBC vanno trattati e siero va decomplementato) ed ELISA. Non servono per diagnosi, ma per screening donatori, studi epidemiologici e monitoraggio di soggetti in terapia. Reazione di agglutinazione = formazione dell’agglutinato. Nei pozzetti a U, gli RBC tendono a depositarsi sul fondo del pozzetto = bottone di RBC sul fondo = REAZIONE NEGATIVA. Quando si ha agglutinazione si formano legami fra Ab e Ag che danno luogo a sedimentazione diffusa in tutto il pozzetto = mancanza bottone = REAZIONE POSITIVA. In IHA (emoagglutinazione indiretta) aggiungiamo emazie con antigene. Per iniziare si devono preparare le diluizioni scalari da 1:20 (es. 10
  siero con 190
  PBS, poi prendo 100
  PBS in tutti gli altri pozzetti e aggiungo 100
  del pozzetto 1 nel 2, poi 100
  del pozzetto 2 nel 3 e così via).

  Diagnosi di specie

  La diagnosi di specie si effettua tramite striscio di sangue ed emozoina. Trofozoita giovane.

  Sintomatologia e quadro clinico

  Le manifestazioni cliniche della malaria sono molteplici e la loro evoluzione si basa sui fattori del parassita, i fattori dell’ospite, i fattori geografici e quelli socio-economici. Statisticamente parlando, se 400 soggetti vengono punti da una zanzara infetta:

  • 200 soggetti (quindi il 50% di 400) contraggono l’infezione
  • 100 soggetti (quindi il 50% di 200) sviluppano una malaria clinicamente manifesta
  • 2 soggetti (quindi il 2% di 100) sviluppano una malaria grave
  • 1 soggetto (quindi il 50% di 2) decede

  Sintomatologia clinica: I sintomi iniziali della malaria sono molto aspecifici, infatti si ha febbre, cefalea, stanchezza, dolori muscolari e nausea/vomito. Solo in seguito si ha la comparsa della caratteristica febbre terzana/quartana ed è per questo che spesso la malaria viene diagnosticata tardivamente. Febbre ad andamento altalenante che coincide con il ciclo schizogonico (da entrata in RBC a rottura RBC), che dura 48h per P. falciparum e altri e 72h per P. malariae legato al rilascio di emozoina fa da ponte su membrana macrofagi per plasmodio, che si lega al toll-like receptor TLR 9 ciclossigenasi attivate e produzione prostaglandine influenza su centro ipotalamico della temperatura. !! Fare prelievo nella fase apiretica per trovare i parassiti nei RBC.

  Malaria grave: una qualsiasi di queste patologie:

  • Malaria cerebrale
  • Anemia grave (++ nei bambini) se Hg<5g/dL. Cause = emolisi, aumento clearance splenica di RBC non parassitati (x aumento attività fagocitante dei macrofagi splenici a causa dell’emozoina) e ridotta emopoiesi (aumentano TNF alta e IL-10 inibizione secrezione di EPO = ridotta emopoiesi).
  • Ipoglicemia
  • Edema polmonare/ARDS
  • Insufficienza renale acuta e acidosi metabolica; causa comune a queste patologie = RBC parassitati bloccati in capillari mediata da TNF-alfa che ne aumenta le capacità adesive = ridotto flusso sanguigno con conseguente ipossia.

  Vaccino commercializzato in paesi endemici utilizzato in bambini con <5 anni. Impedisce casi gravi.

  Babesia

  Babesia è un genere di protozoo che rientra nel Phylum Apicomplexa, sottoclasse Piroplasmia, ed è l'agente eziologico della babesiosi. Il suo ciclo vitale comprende la zecca Ixidus ricinus, che compie il pasto di sangue su grossi ungulati (come cervi e cinghiali) e l'uomo spesso s'infetta quando, visitando le zone boschive (montuose o collinari) dove vivono questi animali, viene punto dalla zecca.

  Per Babesia esiste un rischio trasfusionale piuttosto alto perché lo screening sui donatori riguardo a questo parassita non viene fatto regolarmente e/o viene eseguito solo in alcune zone del nord/est Italia (dove il rischio di contrarlo è più alto). Per identificare le specie di Babesia l'osservazione al microscopio non è sufficiente (la diagnosi morfologica non può essere effettuata), quindi serve necessariamente un'analisi molecolare, solitamente una PCR. Qualora l'analisi molecolare non fosse attuabile, in base ai soli vetrini il clinico può fare esclusivamente una diagnosi di babesiosi generica.

  Diagnosi

  No emozoina + aspetto a croce di Malta. Diagnosi specifica con tecniche molecolari.

  Toxoplasma gondii

  Protozoo dixeno intracellulare obbligato. Felino ingestione carne cruda (roditori uccelli) con infezione ed eliminazione di oocisti. Oocisti vanno a contaminare alimenti (es. verdure) e acque reflue. Uomo si infetta ingerendo alimenti contaminati.

  • Consumo carne di suini e ovicaprini infetti
  • Trasfusione/emoderivati contaminati
  • Trasmissione verticale

  Fasi ciclo

  • Intestinale nell’ospite definitivo
  • Esogena nell’ambiente esterno
  • Endogena nell’ospite intermedio

  Forme

  • Tachizoita – elemento che si riproduce molto velocemente, tipico delle prime settimane di infezioni. Si riproducono per endoduogenia (asessuato). Distrutti da digestione.
  • Bradizoiti – crescono lentamente. Contenuti in cisti tissutali (++ muscoloscheletrico, miocardio, retina e SNC). Gastroresistenti – il contenuto gastrico digerisce la cisti e fa sì che si liberino i bradizoiti nel lume gastrico e poi intestinale nel circolo ematico ritornano tachizoiti.

  Immunità non sterilizzante. Immunità protettiva di tipo cellulo-mediato. IgG persistenti per tutta la vita, IgM permangono alcuni anni. Linfociti Th1 – TNF alfa e IFN gamma= attivazione macrofago con produzione di NO ha effetti diversi in base alla virulenza e al genotipo di T. gondii. Più comunemente si hanno genotipi a virulenza intermedia. Induce la formazione di cisti tissutali con bradizoiti, che rimangono tali fino a che la produzione di ossido nitrico (NO) è costante, oppure mediare con NK per l’uccisione del parassita. Se la produzione di NO cala, si ha la differenziazione in tachizoita – caratteristico degli immunocompromessi.

  Sistemi di evasione di T. gondii

  • Variazione antigeni di superficie
  • Inibizione fusione del fagolisosoma – se il parassita entra attivamente, i lisosomi non riconoscono come da distruggere il macrofago; mentre se viene fagocitato, allora viene distrutto e attaccato dai lisosomi.
  • Modulazione risposta immunitaria dell’ospite

  Manifestazioni cliniche della toxoplasmosi

  La toxoplasmosi può manifestarsi in vari modi:

  • Acquisita: se un soggetto immunocompetente contrae la toxoplasmosi può sviluppare manifestazioni cliniche blande (febbre, astenia e talora l’ingrossamento dei linfonodi cervico-occipitali). Solo nel caso di linfoadenopatia il soggetto s’insospettisce ed effettua delle analisi che vanno a svelare il Toxoplasma. In questi soggetti il decorso dell’infezione è benigno ed autolimitante terapia solo se Toxoplasma si localizza nella retina.
  • Congenita: per trasmissione verticale. Le manifestazioni cliniche variano in base al trimestre di gravidanza in cui avviene l'infezione del feto:
    • Primo trimestre: “tetrade di Sabin” segni neurologici gravi, idrocefalo, calcificazioni intracraniche e corioretinite toxoplasmici aborto
    • Secondo trimestre: idrocefalo, microcefalo e corioretinite;
    • Terzo semestre: ittero neonatale con splenomegalia oppure forme inapparenti con possibili corioretiniti evolutive tardive;
  • Riattivazione: se un soggetto immunocompetente contrae la toxoplasmosi e poi va incontro a una situazione di immunodepressione si ha la ridifferenziazione dei bradizoiti in tachizoiti con conseguente riattivazione toxoplasmica. Febbre, corioretinite, deficit neurologici, meningoencefalite oppure forme extracerebrali (miocardiche e/o polmonari) o disseminate. Nei pazienti con AIDS l’encefalite toxoplasmica poteva essere fatale nel 6-20% dei casi prima dell’introduzione della terapia HAART. La toxoplasmosi da riattivazione rappresenta in generale la più importante causa di lesioni intracerebrali.

  Diagnosi

  Diagnosi indiretta

  • Ricerca di anticorpi specifici di classe IgM, IgG ed IgA
  • Valutazione dell’indice di avidità delle IgG
  • Western blot/immunoblot
  • Toxoferon- gold standard per la diagnosi di Toxoplasmosi. Incubazione dei toxoplasmi vivi con colorante con DYE test – siero del paziente di cui vogliamo valutare presenza Ab. IgG e IgM eventualmente presenti determinano l’uccisione del parassita parassita diventa bianco. L'ultimo titolo in cui il 50% dei toxoplasmi è vivo è il titolo del paziente.
  • Biopsie (quasi sempre si preleva un linfonodo ingrossato e lo si va ad incubare con anticorpi rivolti verso anticorpi anti-Toxoplasma eventualmente presenti nel siero del paziente).

  Diagnosi diretta

  Meno utilizzata e si svolge tramite tecniche per immagini oppure attraverso la ricerca del genoma parassitario all’interno di plasma, lavaggi bronchiali, liquidi amniotici ed umor acqueo sfruttando la PCR. Prima della PCR veniva eseguita la prova biologica, che consisteva nel prelevare il plasma o un altro liquido dal paziente ed inocularlo nella cavità peritoneale della cavia da laboratorio, per poi aspettare 7-10 giorni e scoprire se l’animale sviluppava un’ascite toxoplasmica oppure no; questo metodo è stato sempre meno utilizzato nel corso del tempo sia per questioni etiche, sia per il fatto che richiedeva tempi di attuazione molto lunghi ed era dotato di una minore sensibilità rispetto alle tecniche molecolari moderne; quest’ultime sono in grado di trovare tracce di DNA toxoplasmico in circolo fino a 4 mesi dopo l’infezione e determinare quindi se sussiste il rischio di trasmettere l’infezione attraverso le trasfusioni di sangue.

  Cinetica delle classi immunoglobuliniche in corso di toxoplasmosi

  Che succede quando un animale da laboratorio entra per la prima volta (risposta primaria) in contatto con l’antigene di Toxoplasma?

  • Fase di latenza: Il sistema immunitario è già entrato in contatto con l’antigene ma non ha ancora prodotto gli anticorpi;
  • Fase logaritmica: Il sistema immunitario produce anticorpi in maniera esponenziale (prima vengono secrete le IgM e poi le IgG);
  • Fase di plateau: La produzione di anticorpi ha raggiunto il picco e rimane costante per un certo periodo di tempo;
  • Fase di discesa: Varia in base al tipo d’immunoglobulina:
    • IgM: la loro concentrazione arriva a zero dopo 18 mesi dall’infezione;
    • IgG: la loro concentrazione si abbassa notevolmente dopo 18 mesi dall’infezione;