Microbiologia e immunologia

Microbiologia

Introduzione al mondo microbico

I batteri sono organismi unicellulari appartenenti al gruppo delle cellule procariotiche.

Al contrario, i protozoi e i miceti sono cellule unicellulari eucariotiche, sebbene si distinguano sia dalle cellule animali che da quelle vegetali.

I virus, invece, non possono essere considerati vere cellule; sono strutture biologiche, o più precisamente sistemi genetici, che possono dar luogo a diverse condizioni patologiche, di gravità variabile.

Il tipo di relazione che si sviluppa tra un microrganismo e il suo ospite può variare. Ad esempio, nell'uomo, quella che un tempo veniva chiamata "flora intestinale" è ora meglio nota come "microbiota". Questo rappresenta un sistema in cui si instaura una relazione simbiotica, garantendo un equilibrio fondamentale per la stabilità dell'organismo.

La microbiologia si occupa dello studio delle dimensioni dei microrganismi in vari ambiti, non solo quello medico. Grazie alla microbiologia possiamo individuare quale patologia infettiva, causata da un agente eziologico, effettivamente ha colpito l’individuo, sebbene vi siano somiglianze di sintomatologia. Questo procedimento è conosciuto nel complesso come “diagnosi molecolare ed eziologica”.

Naturalmente, così come le altre discipline, anche la microbiologia ha una sua storia. All’inizio del ‘600/700 era impensabile effettuare una diagnosi molecolare, si era ai primordi della scienza, tant’è che l’informazione genetica si pensava che potesse essere trasportata solo dal DNA. Ad oggi, invece, siamo a conoscenza di un ulteriore acido nucleico, l’RNA (coronavirus, virus dell’epatite C), superando così il dogma centrale della biologia. Oggigiorno, inoltre, è possibile arrivare anche ai fattori di sicurezza e ai geni di resistenza grazie al sequenziamento dell’intero genoma.

Anche i virus possono essere propri di alcune specie piuttosto che di altre. Ad esempio, alcuni sono propri del batterio, altri delle cellule vegetali e altri ancora delle cellule animali. Quando però un virus riesce ad oltrepassare la barriera di specie, quindi non solo ad essere infettante per la specie in cui prima era ma anche, ad esempio, per l’uomo stesso, si parla di “zoonosi” in grado di causare vere e proprie pandemie.

Fra alcuni virus che sono esempio di zoonosi, nonché causa scatenante di alcune pandemie, si ricorda l’HIV, HCV ecc. Tuttavia, i microrganismi di cui abbiamo parlato non hanno effetto solo ed esclusivamente negativo. Infatti, da alcuni batteri è possibile estrarre la birra.

I postulati di Koch sono stati i primi a trovare la causa dell’infezione e lo sviluppo della malattia. Sostengono che l’agente patogeno deve essere isolato dal malato e non dal sano. Se, infatti, dal soggetto malato viene isolato l’agente patogeno e inserito nel soggetto sano, quest’ultimo molto probabilmente sviluppa la malattia. Grazie, infatti, alla microbiologia nasce l’immunologia, il cui compito principale è quello di individuare l’antigene scatenante la malattia proprio dell’agente patogeno. Fondamentali sono anche le campagne di screening che consentono quindi di prevenire la malattia prima che essa si presenti andando proprio ad effettuare delle analisi sull’agente in questione.

La malattia infettiva è, quindi, la conseguenza clinica dell’interazione tra microrganismo e ospite suscettibile a determinate caratteristiche del patogeno. A tal proposito sono da annoverare anche le varie tipologie di vie di trasmissione, fondamentali per sapere dove ricercare il patogeno. La trasmissione della malattia, di conseguenza, è garantita anche dall’intervento di un vettore che può essere di varia natura.

Organizzazione della cellula batterica

La cellula rappresenta l'unità fondamentale della vita. I batteri sono organismi unicellulari di dimensioni ridotte, privi di compartimentazioni intracellulari. Le dimensioni di una cellula batterica variano da 0,2 a 2 micron in larghezza e da 2 a 8 micron in lunghezza.

Fra loro si distinguono per forma nei seguenti:

• Bacilli: a forma di bastoncino; si dividono in Clostridia (anaerobi) e Bacilli (anaerobi e/o aerobi);
• Cocchi: sferici;
• Vibrioni: a virgola;
• Spirilli: a spirale;
• Spirochete: con più curve.

Cocchi

Tali batteri possono trovarsi sotto varie forme, tra cui:

• Diplococchi (cocchi raggruppati in coppie);
• Streptococchi (cocchi a catena);
• Stafilococchi (cocchi a grappolo);
• Tetradi (cocchi in gruppi di 4);
• Sarcina (a forma di cubo).

Bacilli

I bacilli hanno una struttura più allungata, le dimensioni vanno da 0,5-1 micron e 1,4 micron di lunghezza. Sono allungati con estremità arrotondate. Possono trovarsi sotto varie forme:

• Coccobacilli, simile ad un cocco;
• Diplobacilli, bacilli raggruppati in coppie;
• Streptobacilli, catena di bacilli.

Spirilli

Essi vanno dagli 1-100 micron, si dividono in:

• Vibrione (ricurvo, a virgola);
• Spirillo (ispessito, spirale rigida);
• Spirochete (sottile, spirale flessibile).

Componenti essenziali della cellula batterica

La cellula batterica è composta per l'80% da acqua.

Componenti inorganiche: sodio (Na), potassio (K), magnesio (Mg), calcio (Ca), zinco (Zn), ferro (Fe), fosforo (P), zolfo (S).

Componenti organiche: DNA, RNA, proteine, zuccheri e lipidi.

Struttura cellulare

La cellula batterica presenta le seguenti caratteristiche:

• Nucleo senza membrana, con acidi nucleici immersi nel liquido citoplasmatico, in una regione interna della cellula chiamata nucleoide;
• Un solo cromosoma;
• Membrana citoplasmatica rivestita da parete cellulare;
• Flagelli e ciglia, utilizzati per muoversi, fimbrie o pili per ancorarsi ai substrati e per lo scambio di materiale genetico con altri individui.

Parete batterica

È un contenitore rigido che racchiude la cellula e ne condiziona la forma. A seconda del tipo di parete cellulare, i batteri si dividono in Gram positivi e Gram negativi. La parete dei Gram positivi è costituita da uno spesso strato di peptidoglicano: questa trattiene il colorante blu-viola usato nella colorazione di Gram. La parete dei Gram negativi è formata da un sottile strato di peptidoglicano e da una seconda membrana esterna, di natura lipidica: la parete sottile trattiene poco colorante di Gram, per cui i batteri appaiono rosa e sono definiti negativi.

Il passaggio di sostanze può essere passivo, secondo gradiente di concentrazione, oppure attivo. Abbiamo visto i vari sistemi di trasporto della membrana cellulare batterica che consentono la traslocazione dei soluti all’interno o all’esterno della cellula attraverso il consumo di ATP (energia).

• Il trasporto semplice può essere in unica direzione o in due direzioni;
• La traslocazione avviene attraverso delle modificazioni conformazionali delle proteine;
• Il sistema di trasporto ABC avviene anch’esso con un cambio conformazionale delle proteine.

Peptidoglicano

Il peptidoglicano è un polimero di NAG (n-acetil-glucosamina) e NAM (acido n-acetil muramico). Questi sono due amminozuccheri, legati tra di loro da un legame glicosidico β-1,4, sia all’interno del monomero che tra un monomero e l’altro.

• L’N-acetil-glucosamina è glucosio che porta legato al C2 un’ammina, che a sua volta lega un gruppo acetilico (CH3).
• L’Acido n-acetil-muramico è n-acetil-glucosamina che lega al C3 acido lattico e una corta sequenza di amminoacidi.

Tra i due zuccheri c’è un legame glicosidico β-1,4, fra l’atomo di C1 e l’atomo di C4. Questa unità fondamentale si lega a sua volta ad altre unità sempre con legami β-1,4 formando delle catene lineari. Per aumentare la rigidità della molecola si creano delle catene trasversali formate da amminoacidi, sono dei ponti trasversali di tetrapeptidi, che per alcuni batteri sono uguali, per altri sono diversi, e quindi si forma una struttura a foglietto.

Acidi teicoici

Questi foglietti nei batteri gram-positivi formano uno spesso strato oltre la membrana plasmatica. I foglietti, però, si muovono, possiamo perderli, quindi vanno legati attraverso delle molecole: gli acidi teicoici. Questi sono ancorati alla membrana plasmatica e legano i vari foglietti tra di loro, consentendo al batterio di assumere una forma ben definita (cocco, vibrione, bacillo, spirillo).

Gli acidi teicoici sono polimeri presenti nelle cellule batteriche, costituiti da ribitolo esterificato con acidi grassi. Sono altamente antigenici, stimolando la risposta immunitaria attraverso il riconoscimento da parte delle cellule presentanti l’antigene (APC) e dei recettori TOLL-like (TLR), in particolare TLR-2. Questi recettori identificano i pattern molecolari dei patogeni, attivando l’immunità innata. Gli acidi teicoici favoriscono anche l’adesione batterica alle cellule eucariotiche, contribuendo alla produzione di citochine che possono causare sintomi clinici.

Spazio periplasmico

Lo spazio periplasmico è presente sia nei batteri gram + che gram-. È la zona compresa tra membrana citoplasmatica e peptidoglicano, nei Gram +, e membrana citoplasmatica ed esterna, nei Gram -. Ha una consistenza gelatinosa che occupa il 20-40% del volume cellulare. Al suo interno si trovano proteine di trasporto, amminoacidi, fosfati e vitamine. Una delle funzioni della membrana esterna è quella di evitare che alcuni enzimi posti all’esterno della membrana diffondono all’esterno della cellula e questi enzimi sono posti nel periplasma.

• Ha uno spessore di circa 12-15 nm.
• Contiene enzimi che permettono al microrganismo di mantenere un diverso gradiente di concentrazione.

Membrana citoplasmatica

È formata da un doppio strato fosfolipidico, più flessibile rispetto a quella eucariotica a causa della mancanza di steroli (colesterolo). Contiene proteine per il trasporto di prodotti e nutrienti, pompe ioniche per il potenziale di membrana, enzimi per la respirazione, trasporto di elettroni.

Essa presenta uno spessore di 80 Amstrong, le proteine possono essere periferiche o integrate nel doppio strato. Tra le funzioni della membrana vi sono:

• Barriera selettiva: lascia passare per diffusione passiva, ovvero per gradiente di concentrazione da maggiore minore, solo molecole piccole;
• Sistema di trasporto attivo (pompe ioniche) che necessita di ATP;
• Produzione di energia (ATP);
• Processi biosintetici (sintesi di peptidoglicano).

Lipopolisaccaride (LPS), antigene O

Il lipopolisaccaride o endotossina batterica si trova sulla parte esterna della membrana plasmatica esterna dei batteri Gram-negativi ed è composto da tre parti: core.

• Lipide A;
• Un core oligosaccaridico;
• L'antigene O, una catena polisaccaridica formata da 20-50 unità ripetitive.

Il lipide A è la porzione tossica del LPS, non è l’endotossina intera, e conferisce resistenza alle interazioni idrofobiche che potrebbero danneggiare la membrana cellulare. La tossicità dipende dalle catene di acidi grassi (lunghezza, diversità, ecc.) che possono aumentare e diminuire il potere tossico del lipopolisaccaride. È formato dal disaccaride di glucosamina esterificato con acidi grassi che possono essere diversi, questo definisce la tossigenicità, ad esempio l’LPS di legionella è poco tossico così come quello della salmonella. Tutto dipende dalla struttura dei microrganismi e questo si riflette nel percorso diagnostico, nelle caratteristiche di virulenza, nella patogenesi che influenzerà il percorso terapeutico. Sono presenti gruppi fosfato, che servono per legarsi al core.

Il core è una corta sequenza di zuccheri comune a tutti i batteri. Fra questi zuccheri abbiamo un eptoso e l’acido chetodeossioctonoico (KDO). Presenta una parte interna (inner core) rappresentata dal KDO, che presenta 8 atomi di carbonio ed eptosio e una parte esterna (outer core) formata da zuccheri semplici (glucosio, galattosio e fruttosio) che andranno a legarsi con il polisaccaride O.

Antigene O / polisaccaride O: formato da n zuccheri (catena lunga fino a 40 zuccheri), definita anche regione variabile, perché cambia il numero di zuccheri e viene riconosciuta dal sistema immunitario (è l’antigene e si lega al recettore presente sull’ospite). In alcuni casi protegge il batterio dall’azione dei fagociti, cioè riesce a resistere al killing endocellulare. Il sistema immunitario dell’ospite riconosce il microrganismo e inizia a produrre ed attivare una cascata di eventi che portano alla formazione di macrofagi, la cui funzione è quella di fagocitare il microrganismo, ma in alcuni casi, il batterio sfrutta l’azione dei fagociti per restare immobile e causare il danno.

In alcune condizioni, come la morte o la replicazione batterica, i lipopolisaccaridi (LPS) vengono rilasciati e si legano ai recettori CD14, il loro legame con il LPS li porta a interagire con i recettori toll-like, in particolare il Toll-like 4. Questo attiva una cascata proteica che culmina nell'attivazione di NF-κB, un fattore di trascrizione che regola l'espressione genica e stimola la produzione di citochine.

Il lipopolisaccaride può causare danni molto gravi, specialmente in alte concentrazioni, portando a una risposta immunitaria deregolata, come la sepsi, caratterizzata da vasodilatazione periferica, abbassamento della pressione sanguigna, febbre e formazione di trombi.

Citoplasma

All’interno della membrana plasmatica vi è il citoplasma, materiale semifluido entro cui avvengono le reazioni cellulari. Il citoplasma è composto da due parti: il citosol, che è la parte più fluida, e le particelle insolubili sospese in esso. Non contiene organuli ed è fortemente basofilo, più delle cellule eucariotiche, a causa dell’alto contenuto di RNA.

Nucleoide

Una particolare zona del citoplasma, chiamata nucleoide, contiene il DNA cromosomale, che si trova sotto forma di un’unica molecola di DNA bicatenario, circolare, alla quale sono associate proteine, anche se non in modo altamente organizzato. È caratterizzata dall’assenza di istoni. Genoma aploide.

Ribosomi

Nel citoplasma sono sempre presenti i ribosomi liberi del diametro di 25 nm, in cui ha luogo la sintesi proteica. I ribosomi sono costituiti da RNA e proteine. Inoltre, il batterio, per crescere utilizza tutte le vie metaboliche, producendo e utilizzando ATP. Una delle vie metaboliche è rappresentata dalla sintesi proteica, la quale nel batterio avviene mediante l’utilizzo di ribosomi 70S (50s+ 30s).

Mesosomi

A volte sono presenti delle inclusioni plasmatiche definite mesosomi, i quali servono alla duplicazione del DNA. All’inizio si pensava fossero introflessioni casuali.

Plasmidi

I batteri tuttavia presentano i plasmidi, ovvero materiale genetico extracromosomico circolare più piccolo, i quali non danno informazioni genetiche necessarie alla scissione binaria. Essi sono in grado di effettuare la replicazione in maniera autonoma rispetto al DNA genomico. Essi codificano per geni non essenziali ma offrono un vantaggio selettivo, ad esempio per la resistenza a farmaci, coinvolti nei meccanismi di scambio genetico, produzione di tossine. I batteri sono sottoposti alla fitness Darwiniana, ovvero possiedono la capacità di adattarsi e di modificare le proprie caratteristiche in base all’ambiente esterno. Tuttavia, essi non sono essenziali alla sopravvivenza del batterio.

Strutture accessorie

Oltre le strutture principali le cellule batteriche hanno anche delle strutture accessorie:

• Flagelli;
• Villi;
• Glicocalice;
• Capsula.

Queste strutture possono sembrare non necessarie al batterio ma sono in grado di determinare i fattori di virulenza di un determinato microrganismo. (Es. la capsula protegge il batterio dall’ingresso di alcuni antibiotici; i pili permettono l’aggancio sulla membrana mucosa; i flagelli aumentano la mobilità e la capacità invasiva del microrganismo; cromosomi e plasmidi. Alcuni batteri formano spore che possiedono un meccanismo di resistenza dei batteri permettendogli di resistere a situazione avverse.)

Glicocalice

È un rivestimento esterno cellulare dei Gram positivi e dei Gram negativi, generalmente formato da polisaccaridi etero o omo polimerici. Può possedere una capsula altamente organizzata. Può avere uno strato mucoso (slime) che è diffuso, scarsamente adeso e lasso. Non è necessario per la crescita del batterio ma è improntata per la sopravvivenza all’interno dell’ospite.

La sintesi è regolata da diversi fattori genetici oppure ambientali, se il microorganismo percepisce che c’è un fattore avverso per proteggere la specie si adatta. I batteri non sprecano energia, infatti, attuano la via metabolica solo se necessaria (es. operone LAC), a differenza dell’uomo.

Funzioni:

• Protezione;
• Limita l’ingresso di molecole idrofobiche tossiche (antibiotici o disinfettanti);
• Adesione ai tessuti e materiali inerti (esempio S. mutans-> carie dentarie);
• Formano Biofilm che proteggono sia il singolo patogeno che un gruppo di patogeni da attacchi dal sistema immunitario. (La problematica di questo biofilm è per coloro che hanno la fibrosi cistica.)

Capsula

La capsula batterica è una struttura più organizzata rispetto allo slime, composta da glicoproteine e una matrice fibrosa esterna, che riveste batteri Gram-positivi e Gram-negativi. È più comune nei batteri patogeni in vivo, mentre tende a scomparire in vitro.

Essa facilita l'adesione ai substrati, ha un'attività anti-fagocitaria che ostacola la risposta immunitaria non specifica, e protegge dai farmaci impedendo agli antibiotici di raggiungere i bersagli.

La sua presenza viene rilevata con la colorazione negativa all'inchiostro di china, che ne evidenzia il rigonfiamento. La c