Microbiologia - Appunti

La microbiologia

La microbiologia è una disciplina di base che studia i microrganismi. I microrganismi sono piccoli (0,2 micron a qualche micron), unicellulari che possiamo ritrovare in tre domini: bacteria, archea e eukarya. La microbiologia comprende anche i virus, i quali sono particelle che necessitano un ospite da infettare per sopravvivere. Esempi di procarioti sono tra i batteri e gli archea, ma ci sono anche negli eucarioti come ad esempio le alghe e i funghi oltre al gruppo dei protozoi e i virus.

Nell'albero filogenetico, vediamo una maggioranza di batteri da cui parte una ramificazione che ha dato vita agli archea dal quale si sviluppa il ramo degli eukarya. Nei batteri ci sono tante diramazioni che terminano con tante specie microbiche. Con i pallini rossi si identificano le specie che non siamo riusciti ad isolare e quindi a coltivare in laboratorio.

La microbiologia si occupa di quella cellulare, ambientale, molecolare, virologia, ecologia microbica, genetica e quella medica a partire da studi di base come genetica, biochimica, biologia molecolare, ecologia, biologia cellulare, bioinformatica, chimica, farmacologia e immunologia. Le aree applicative sono l'industria agro-alimentare, medicina diagnostica, biotecnologie ambientali e industriali, ambiente ed energia e industria chimica. È una scienza di base perché permette di studiare la morfologia e struttura delle cellule batteriche, ma anche per il ruolo dei microrganismi nell'ambiente (ciclo dell'azoto). È anche importante per le interazioni dei batteri con l'ospite (ormai c'è un asse intestino-cervello per alcune attività intestinali benefiche per l'uomo).

Storia della microbiologia

È una disciplina giovane che è stata studiata dalla fine dell'800. Seppur non li possiamo vedere ad occhio nudo, possiamo vederli in modo aggregato ad esempio i corpi fruttiferi nei funghi, sedimenti in acqua o biofilm. I microrganismi sono visti nei processi di panificazione del lievito e fermentazione della birra. Quindi noi ce ne cibiamo, ma altri ci fanno ammalare.

La prima rivoluzione tecnologica è stata l'avvento del microscopio nel XVII secolo che ha aiutato la scoperta dei microbi. Robert Hooke nel 1665 pubblicò l'esatta descrizione di un microscopio con una sola lente e disegni dei corpi fruttiferi dei funghi. Il primo a descrivere i batteri, lieviti e protozoi fu Antonj van Leeuwenhoek, commerciante di stoffe. Era un appassionato di microscopi che potevano raggiungere ingrandimenti di circa 50-300 volte, e li sfruttava per il suo lavoro. Nel 1676 descrisse e disegnò le cellule di alcuni 'animalcules', batteri e lieviti.

Dopo queste iniziali scoperte, l'esplorazione del mondo microbico si fermò per 100 anni. Il microscopio di Leeuwenhoek presentava una lente all'interno di una piastra metallica con una convessità per vedere il campione e contenente un ago che analizzava piccoli campioni e due viti che permettevano di osservare il campione in verticale e in orizzontale.

Nel 1800, Ferdinand Cohn studiava le alghe unicellulari e isolò il batterio Beggiatoa. Paul Ehrlich sviluppò nel 1881 la 'colorazione vitale' dei batteri con il blu di metilene. Nel 1884, Hans Christian Gram, medico e farmacologo danese, sviluppò un metodo di colorazione differenziale che da lui prese il nome di colorazione di Gram.

In questi anni si aprì il dibattito sull'evoluzione e sulla nascita della teoria della generazione spontanea dei microrganismi. Si pensava nascessero spontaneamente, ad esempio dal cibo in putrefazione nascevano larve di insetti o dalle acque stagnanti insetti o girini e perfino topini dalle derrate alimentari. Il dibattito scientifico e filosofico sulla generazione spontanea durò fino alla fine del XIX secolo. Finché degli studiosi confutarono questa teoria con lo sviluppo della teoria cellulare e della biogenesi.

Il medico italiano Francesco Redi nel 1668 fece uno dei primi tentativi di confutazione. Poi ci furono altre confutazioni, ma rimaneva il problema dell'origine dei microrganismi. Furono fatti molti esperimenti; il primo di Redi fu quello di mettere un pezzo di carne in un contenitore aperto. Dopo qualche giorno vedeva lo sviluppo di alcuni organismi. Invece coprendo la carne non vedeva organismi, quindi intuì che era qualcosa che veniva dall'esterno che interagiva con la carne. Il terzo esperimento prevedeva la carne coperta da una garza che non permetteva il passaggio di cose più grandi ma solo quelle piccole. In questo caso le larve e gli insetti non si formavano. L'ultimo esperimento prevede che un pezzo della garza usata nell'esperimento precedente sia posta sulla carne, e vide che si sviluppavano organismi. Quindi la garza contiene qualcosa che favorisce la vita di quelle larve, quindi confutò la generazione spontanea, ma c'era qualcosa di molto piccolo.

Spallanzani osservò che in un brodo di carne sottoposto a bollitura prolungata non si osservava crescita se si sigillava la fiasca in cui era stato bollito. La bollitura distruggeva i microrganismi viventi, ma se la lasciavo aperta essi riapparivano. L'obiezione era stata che la bollitura distruggesse la 'forza vitale'. Un secolo dopo ci fu la confutazione decisiva da parte di Louis Pasteur. Usò una fiasca per metterci il brodo di carne, ma le diede una curvatura a cigno facendo depositare il materiale polveroso dell'aria. Se sterilizzo con la fiamma il contenitore e lo divido in due vedo che: in alto vedo che la chiusura a cigno capta gli organismi viventi che potrebbero entrare con la polvere, lasciandolo per un lungo intervallo di tempo non si avrà contaminazione con il brodo, mentre in basso vedo che inclinando la fiasca parte del brodo può venire a contatto con ciò che c'è nel collo a cigno, in esso si sviluppano dei microrganismi in un breve intervallo di tempo. Quindi nell'aria ci sono delle forme viventi che non si vedono che a contatto con il liquido possono crescere, quindi viene confutata la generazione spontanea.

Poi si svilupparono la teoria cellulare e la teoria della biogenesi che postula che ogni cellula deriva da un'altra cellula, e ogni organismo vivente è generato da un altro organismo vivente. Le contraddizioni di questa teoria stavano per essere affrontate attraverso lo sviluppo delle teorie evoluzioniste di Lamarck e Darwin e dagli studi sull'origine della vita. Robert Koch sviluppò un metodo per coltivare i microrganismi su terreno solido attraverso l'uso di gelatina o l'uso di fette di patata sulla cui superficie potevano crescere formando delle colonie. Walter Hesse introdusse l'uso dell'agar come agente solidificante per i terreni di crescita. Petri nel 1887 introdusse l'uso di scatole di vetro, le capsule (o piastre) di Petri. Così si poté iniziare a coltivare i microrganismi in piastra.

Ma nel periodo storico in cui vissero gli scienziati, la microbiologia si è sviluppata nell'ambito delle malattie infettive. Già nel 1546 Girolamo Fracastoro di Verona pubblicò 'De contagionem'; alcune malattie causate da forme viventi invisibili che si potevano trasmettere per contatto diretto attraverso 'oggetti inanimati' e a distanza. Casimir Davaine dimostrò che Bacillus anthracis poteva causare il carbonchio, una malattia degli animali. Joseph Lister sviluppò una tecnica di antisepsi chirurgica. La teoria microbica delle malattie è dovuta al lavoro di Robert Koch e Louis Pasteur. La prima parte della microbiologia che si sviluppò fu quella medica, clinica.

Koch isolò per la prima volta un microrganismo causa di malattia e dimostrò che Bacillus anthracis è l'agente eziologico del carbonchio. Koch isolò Mycobacterium tuberculosis e il vibrione del colera. Sviluppò i criteri generali/sperimentali per definire se un determinato agente biologico è causa di una malattia, i postulati di Koch. Nel 1905 fu insignito del premio Nobel per la medicina.

• 1° Postulato: devo saper distinguere l'animale sano da quello malato che presenta il patogeno.
• 2° Postulato: una volta isolato il patogeno può essere coltivato.
• 3° Postulato: prendendo un animale sano e iniettandogli il sospetto patogeno, deve diventare malato.
• 4° Postulato: devo poter ri-isolare il patogeno e poterlo controllare in piastre in coltura pura.

Oggi sono ancora considerati i postulati di Koch, però sappiamo che ci sono delle eccezioni come ad esempio gli esemplari che sono asintomatici, o non tutti i microrganismi sono coltivabili. Questi postulati sono stati portati avanti dalla microbiologia molecolare che ha riconvertito le affermazioni di Koch in postulati molecolari: dobbiamo essere certi che inattivando un certo gene diminuisce la virulenza e l'introduzione di un gene in un ceppo non patogeno lo deve trasformare in patogeno.

Louis Pasteur, oltre al contributo per la confutazione della teoria della generazione spontanea, fu molto attivo nello sviluppo di vaccini. Nel 1885 somministrò per la prima volta ad un uomo il vaccino per la rabbia. Il grande successo ottenuto portò alla fondazione dell'istituto Pasteur di Parigi.

Evoluzione e biodiversità

La lotta alle malattie infettive portò alla maggiore conoscenza relativa alla patogenicità di microrganismi, quindi iniziò lo sviluppo degli antibiotici. Alexander Fleming, medico scozzese che faceva ricerche presso il St. Mary’s Hospital di Londra, scoprì nel 1929 la penicillina che è una sostanza prodotta da un fungo del genere Penicillium. Nel 1930, Gerhard Domagk, che lavorava alla Bayer Chemical Company in Germania, scoprì i sulfamidici, ancora oggi usati come agenti antimicrobici. Da allora sono state scoperte una ventina di classi di antibiotici, diverse per meccanismo di azione, prodotte da batteri e da funghi e sviluppate per uso medico.

La scoperta della diversità microbica fu fatta grazie a Martinus Beijerinck e Sergej Vinogradskij che furono i primi microbiologi a studiare microrganismi dell'ambiente. Nel 1800 si sviluppò la microbiologia ambientale, studiando i batteri nei diversi ambienti e ambiti. Martinus Beijerinck sviluppò la tecnica delle colture di arricchimento ed isolò numerosi batteri con specifici metabolismi come: azoto fissatori (Azobacter chroococcum), solfato-riduttori, zolfo-ossidanti e lattici.

Vinogradskij introdusse il concetto di chemiolitotrofia (microrganismi in grado di usare sostanze che possono essere ossidate a dare energia) e coniò il termine autotrofia (assimilazione del carbonio derivano dall'uso della CO₂). Attraverso la colonna di Vinogradskij sono stati definiti questi concetti perché essa è di fatto una coltura di arricchimento che permette la stratificazione dei diversi microrganismi con diverse capacità metaboliche lungo la colonna d'acqua. Immaginiamo una colonia di acqua nella quale avremo a seconda delle condizioni ambientali diverse concentrazioni microbiche. Nella colonna si avrà una differente concentrazione d'ossigeno, in basso la zona è anaerobica e risalendo aumenta fino alla zona aerobica. Nella parte più bassa possiamo ritrovare delle sostanze organiche come la cellulosa che può essere fermentata. Abbiamo microrganismi fermentanti e un prodotto della fermentazione può essere l'idrogeno che risale la colonna d'acqua e man mano che risale trova zone ricche di solfato. Le zone in cui idrogeno e solfati si legano presentano i solfuri, troveremo dei solfato-riduttori che risaliranno la colonna. Nella zona più intermedia ci sarà una diversa stratificazione della concentrazione di solfuri. La zona più bassa intermedia sarà quella anossica ma con i solfuri possiamo ritrovare batteri che sono considerati fototrofi anossigenici. Tutti i batteri che fanno fotosintesi anossigenica e usano H₂S come donatore di elettroni. Poi una zona interfaccia tra la zona ossica e quella anossica presenta meno solfuri e ritroveremo i batteri dove avviene la chemiolitotrofia fino a giungere alla zona più alta, aerobica, e troviamo batteri zolfo-ossidanti. Fino ad arrivare a batteri che in presenza della luce sono in grado di fare fotosintesi ossigenica (come alghe e cianobatteri). Attraverso le diverse condizioni ambientali, i microrganismi colonizzano i loro habitat. Hanno un ruolo fondamentale nell’ambiente.

A questo punto, con tale diversità microbica, è stata necessaria trovare metodi di classificazione dei microrganismi. Inizialmente si aveva un grande raggruppamento dei protisti che comprendeva funghi, alghe, batteri e piante. Poi l'evoluzione dei sistemi di classificazione ha portato alla divisione del mondo procariote e quello eucariote, fino ad arrivare alla classificazione dei domini: batteri, archea, eukarya grazie a Woese nel 1990. A partire dagli anni '60, si cominciarono a sviluppare metodi basati sull'analisi e la comparazione del materiale genetico come mezzo per determinare le relazioni filogenetiche tra organismi diversi. Carl Woese applicò il concetto di filogenesi molecolare all'analisi delle sequenze nucleotidiche dell'RNA ribosomiale. Woese propose il nuovo phylum degli archea, diverso ma correlato filogeneticamente sia ai batteri sia agli eucarioti. Venne identificato il marcatore molecolare che ci fa distinguere i diversi batteri, cioè rRNA 16S e confrontandole si è arrivati alla vera e propria classificazione. Così sono stati descritti degli alberi filogenetici in cui le distanze delle frecce rappresentano le loro distanze filogenetiche. Gli archea partono da un ramo che raggiunge gli eucarioti. Quindi la microbiologia è composta da tante branche.

Albert Jan Kluyver definì la moderna concezione di unitarietà nelle reazioni biochimiche. Oswald Avery nel 1944 dimostrò che il DNA è la sede del materiale genetico. Nel 1943, con esperti condotti su Neurospora crassa, George Beadle e Edward Tatum formularono l’ipotesi che ogni gene codifica per una proteina. Negli anni '40 furono scoperte la coniugazione e la traduzione. Kary Mullis nel 1985 sviluppò la tecnica della reazione a catena della polimerasi nota come PCR. Dopo il 2000 è stato caratterizzato il cosiddetto sistema CRISPR-Cas.

La Terra si è formata circa 4,5 miliardi di anni fa sulla base di analisi di isotopi radioattivi a lento decadimento. Inizialmente, le condizioni non erano favorevoli alla vita. Un’ipotesi sostiene che la vita possa aver avuto origine ben al di sotto della superficie terrestre a sorgenti idrotermali sul fondo dell’oceano. In questo ambiente c’è un’ampia disponibilità di sostanze inorganiche ridotte come idrogeno e idrogeno solforato che fornivano energia. Qualche forma di chimica prebiotica deve aver facilitato lo sviluppo dei primi sistemi auto-esplicanti, i precursori della vita cellulare come alcuni amminoacidi, zuccheri e basi nucleotidiche (forse la vita è iniziata in un mondo di RNA). La vita parte dall’RNA che trasmette informazione ma ha anche l’abilità di avere delle attività catalitiche.

Però si pensa che il ruolo più importante l’abbiano avuto delle proteine che attraverso la trascrizione portano l’RNA a DNA. Il DNA è una molecola molto più stabile dell’RNA, quindi porta le informazioni genetiche. A partire dall’aumentare della complessità dei sistemi data dal DNA, si è arrivati al primo sistema biologico primordiale in cui l’RNA si è evoluto in DNA trasformando tutte le informazioni. Si parla di un successivo evento di possibili riarrangiamenti e ricombinazioni, quindi la prima cellula può aver subito un’evoluzione col riarrangiamento orizzontale o verticale alle informazioni genetiche. Questa cellula poi avrà una successiva divisione che ha posto la base per la divisione nel mondo dei procarioti in batteri e archea. L’ultimo antenato universale comune (LUCA) deve essere esistito 3,8-3,7 miliardi di anni fa.

Il passaggio da un mondo di RNA a quello di DNA è stato un vantaggio per la stabilità del DNA. Da LUCA inizia l’evoluzione della vita. Quindi la formazione degli oceani ha portato ad un ambiente favorevole per la vita. LUCA porta poi alla divisione tra batteri ed archea. Il metabolismo energetico delle cellule primitive sarebbe stato esclusivamente anaerobico. Sembrava che sui fondi oceanici ci fossero delle fumarole, e nei pori della matrice minerale potevano costituire dei microambienti in cui si sarebbero sviluppate le componenti principali delle cellule come amminoacidi, zuccheri e acidi nucleici. Troviamo anche un’evoluzione dei foglietti lipidici che sono le prime forme delle cellule che sono andate a costituire le membrane fino ad arrivare alla formazione dei primi organismi. Durante questo periodo, la CO₂ potrebbe essere stata la principale fonte di carbonio per le cellule. L’H₂ era un combustibile importante per il metabolismo energetico delle cellule primitive con un’idrogenasi primitiva. Con questo processo si pensa si potesse trasformare l’idrogeno in composti come l’H₂S essendo lo zolfo molto presente negli ambienti dei fondali. Lo zolfo elementare potrebbe essere stato uno dei primi accettori di elettroni. Queste prime forme di metabolismo chemiolitotrofico porta a composti che possono permettere l’accumulo di energia attraverso la fissazione autotrofica di CO₂.

3,5 miliardi di anni fa, troviamo anche l’origine di organismi in grado di fare la fotosintesi anossigenica. Venivano usate come donatore di elettroni come l’H₂S e generando zolfo elementare come prodotto di scarto. Da 2,5-3,3 miliardi di anni fa, gli antenati degli odierni cianobatteri hanno evoluto un fotosistema capace di fotosintesi ossigenica generando O₂ come prodotto di scarto. Questo cambierà il corso dell’evoluzione sulla Terra perché l’ossigeno è uno dei principali agenti ossidanti.