Medicina interna/Immunologia clinica

Immunologia clinica – Prof. Migliorini

Antigene = sostanza che reagisce con anticorpo o con un recettore di cellule T.

Autoantigene = antigene self, cioè proprio dell’organismo.

Le malattie autoimmuni è una risposta immune, umorale o cellulare, diretta verso antigeni self.

Se antigene non-self incontra anticorpo viene distrutto. Quando si parla di antigeni self, l’eliminazione non è possibile à danno infiammatorio cronico ai tessuti da parte di meccanismi effettori della risposta immunitaria.

Le malattie autoimmuni si classificano in:

• Malattie sistemiche risposta verso antigeni ubiquitari [es. lupus sistemico, artrite reumatoide, polimiosite…] à
• Organo specifiche la risposta è diretta verso antigeni tipici di un certo organo [es. tiroidite autoimmune; à diabete tipo 1; sclerosi multipla…]

Sistema immune normale

Nel sistema immune normale:

• Cellule T e B sono in grado di rispondere a qualsiasi patogeno.
• Da questo repertorio, sono eliminati i recettori che legano gli antigeni self con alta affinità.
• Cellule T e B auto reattive sono presenti anche nei sani ma non maturano ad effettori.

Lo sviluppo della malattia autoimmune scaturisce dal:

• Fallimento della tolleranza centrale che aumenta il numero di cellule auto reattive.
• Difetto nel meccanismo di controllo dell’attivazione delle cellule auto reattive e la loro evoluzione in cellule effettrici.

Durante lo sviluppo delle cellule B da midollo à osseo organi linfoidi à à incontro con antigene à moltiplicazioni cloni che fanno anticorpi con maggiore affinità con antigene centro à germinale à

• Cellule della memoria.
• Plasma cellule a lunga vita.

Nel centro germinativo si generano vari cloni di B con una vasta gamma di anticorpi di superficie che hanno varia affinità per antigeni. In questo meccanismo, si possono creare cellule che hanno affinità anche per antigene self, che va quindi eliminata.

Tolleranza al self: cellule B

1. La cellula B immatura che riconosce antigeni self, a livello del midollo, va incontro ad un receptor editing (= rivalutazione del recettore per l’antigene con modifica della catena leggera e tentare di cambiare recettore; se dopo, non + più autoreattiva, prosegue verso la periferia), delezione o anergia.
2. La cellula B matura che riconosce antigeni self, in assenza di T helper specifiche va incontro ad apoptosi.

Il punto chiave è non azzerare autoanticorpi, che esistono in tutti, ma far sì che la loro soglia sia molto molto bassa.

Cellule T helper

A. CD4+ possono differenziarsi in diversi fenotipi = Th1 - Th2 - Th17 – Treg (identificabili in base alle citochine à che producono).

a. Th1 indotte da cellule presentanti l’antigene (APC) che, quando hanno a che fare con certi tipi di à germi (virus + batteri), produce IL-12 in ambiente ricco di IL-12, le cellule CD4+ naïve evolvono in Th1 à producono IFN-gamma + IL-2 + TNF alfa à

b. Th2 quando APC incontrano parassiti o altri patogeni IL-4 e IL-13 cellule B naïve diventa Th2 à à à à IL-4 + IL13 + IL-5.

Interazione APC – cellule T

Interazione APC – Cellule T = complesso maggiore di istocompatibilità.

1. Cellula dendritica (APC) incontra antigene, che viene frammentato, legato alle molecole di istocompatibilità (MHC classe II).
2. Segnale 2 da molecole costimolatorie.
3. Segnale 3 da molecole polarizzanti (es. citochine liberate dalla cellula dendritica).

Differenziazione cellule T

Differenziazione cellule T à Patologie legate ai meccanismi effettori:

• Th1 artrite reumatoide, DM à tipo 1, sclerosi.
• Th2 malattie allergiche à

Tolleranza per cellule T

1. Delezione a livello del timo delle cellule T immature che riconoscono antigeni self ubiquitari.
2. Delezione o anergia di cellule T mature che incontrano antigeni self espressi perifericamente in quantità elevate.

• Tolleranza centrale per linfociti T gene AIRE = determina l’espressione di antigeni organo-specifici, quindi à grazie alla sua attivazione, nel timo ci sono gli auto-antigeni di vari organi cellula T immatura viene à presentata agli autoantigeni e, se mostrano una alta affinità, vanno incontro ad apoptosi. Le cellule che riconoscono il self a bassa affinità possono passare in periferia.
• Tolleranza periferica à esistenza di cellule dendritiche che non possono dare segnali stimolatori (perché esprimono MHC-o peptidi self) che bloccano risposta, quindi cellula T inutile.

Controllo della soglia di attivazione o

Malattie autoimmuni

Cellule B e T specifiche per autoantigeni non vengono eliminate o silenziate evolvono ad effettori = T effettrici e B à produttrici di Ab ad alta affinità.

Le risposte T possono causare danno diretto (T citotossiche, attivazione macrofagi) oppure indirettamente (T helper espandono cellule B produttrici di autoanticorpi).

Genetica ambientale - malattie autoimmuni! Relazione con infezione.

A. Infezione crea una over risposta delle APC espressione self antigen autoimmunità à à

B. s-

• Tipo 1 elemento di danno = produzione IgE malattie di tipo allergico à à
• Tipo 2 e 3 reazioni mediate da autoanticorpi IgG. Nelle reazioni di Tipo 2 abbiamo produzione di à autoanticorpi per antigeni espressi sulla membrana cellulare o matrice del tessuto. Nelle reazioni di tipo 3 l’antigene è solubile = formazione di immunocomplessi (= malattie da immunocomplessi).
• Tipo 4 mediati da citochine. à

Esempi

Anemia emolitica prodotti anticorpi diretti verso gli antigeni di membrana dei RBC lisi dei RBC oppure fagocitosi e à à distruzione RBC.

Miastenia gravis anticorpi anti-recettori acetilcolina (importante nella giunzione neuromuscolare). In questa à condizione, vengono prodotti auto-anticorpi contro il recettore dell’acetilcolina, che verrà legato dagli anticorpi, impedendo il legame tra recettore specifico e acetilcolina no contrazione. à

Ipertiroidismo autoimmune a livello ipofisario viene prodotto TSH che induce tiroide alla produzione di ormoni. In à malattia di Graves, vengono prodotti autoanticorpi verso recettori TSH anticorpi hanno effetto TSH simile e la tiroide à viene attivata a produrre in maniera esagerata ormoni tiroidei.

Encefalomielite autoimmune topi con proteina basica della mielina, stimola produzione autoanticorpi contro mielina à neurodegenerazione con paralisi. à

Diabete tipo 1 cellule T citotossiche azione contro cellule B delle isole di Langerhans distruzione autoimmune delle à à cellule producenti insulina.

Studio delle cellule T: fenotipo e funzioni

Sorgenti sangue periferico + tessuti à

Linfociti in sangue periferico T=65-75%; B= 5-10% e NK= 5-15% à

NK cells

• Distinguono le cellule sane da cellule tumorali o infettate grazie a bilancio fra segnali attivatori e inibitori la à loro attività viene regolata.
• Identificate come CD3-, CD16+ e CD56+ anche linfociti T ad attività NK esprimono CD16 e CD 56 à
• Attivazione mediata da recettori MHC-I, che vengono riconosciuti su cellule self. Se la cellula non lo mostra o mostra un recettore diverso NK può essere attivata o inibita a seconda dei trasduttori presenti nella cellula à target.
• I recettori inibitori di NK legano MHC-I se non vengono trovati, prevalgono i meccanismi attivatori e la NK si à à à attiva contro la cellula target liberano delle perforine e altre molecole distruzione cellula target.
• Esistono recettori NK specifici NKp46, NKp30 e NKp44 (solo su NK attivate) à

Cellule T CD4+ e CD8+

Questi due tipi di cellule T prendono contatto e riconoscono MHC diversi:

CD8+ interagiscono con MHC-I ed esercitano attività litica su cellule infettate. à

CD4+ interagiscono con MHC-II, di cui fanno parte cellule TH1 (attivano macrofagi e monociti con citochine x germi a à crescita intracellulare) e cellule TH2 (liberano citochine per maturazione e differenziazione cellule B).

Destino delle cellule T helper (CD4+) Th1, Th2, Th17 e Treg in dipendenza del microambiente in cui si differenziano. à

Ogni subset produce diverse citochine e promuove in vari modi la risposta infiammatoria.

Isolamento da sangue periferico

Isolamento mediante gradienti di cellule mononucleate (linfociti)

1. Isolamento mediante gradienti di cellule mononucleate (linfociti)

• Utilizzo del Ficoll-Hypaque (= miscela di carboidrato polimero Ficoll e metrizamide; densità 1077).
• Separazione delle cellule nel sangue periferico in base alla loro densità dopo centrifugazione à
• Prelievo con anticoagulate – diluizione 1:2 con terreno per colture cellulari (RPMI) – stratificazione su Ficoll (depositare dolcemente il sangue su Ficoll evitando miscelazione) – centrifugazione a 400g per 30’ – rimozione plasma -- trasferimento delle cellule all’interfaccia (cellule mononucleate) – diluire con RMPI o altro terreno di coltura specifico – centrifugazione a 200g per 10’.

Isolamento mediante gradienti di granulociti

Isolamento mediante gradienti di granulociti:

Stratificazione su doppio gradiente di Histopaque o (polisaccarosio e sodio ditrizoato) 1,077 e Histopaque 1,119.

Separazione delle cellule nel sangue periferico in o base alla loro densità dopo centrifugazione à

Prelievo con anticoagulate – diluizione 1:5 con PBS-o EDTA – stratificazione su Ficoll (depositare dolcemente il sangue su Ficoll evitando miscelazione) – centrifugazione a 400g per 30’ – rimozione plasma -- trasferimento delle cellule all’interfaccia (cellule mononucleate) – diluire con RMPI o PBS – centrifugazione a 300g per 10’ -- Risospendere il pellet in soluzione di cloruro d’ammonio (per lisare i globuli rossi).

Isolamento da tessuto linfoide

Isolamento da tessuto linfoide

Mettere tessuto in capsula Petri con terreno e frammentarlo con bisturi o sminuzzarlo con vetrini o zigrinati.

Caricare la sospensione di cellule ottenuta su Ficoll o Stessa metodica dell’isolamento su sangue periferico mediante gradiente o

Isolamento attraverso citofluorimetro a flusso

2. Isolamento attraverso citofluorimetro a flusso possibilità di differenziare e colorare le cellule in base à all’espressione di diversi antigeni di membrana. Quindi, in base alla fluorescenza dei vari tipi cellulari, le cellule con la fluorescenza voluta (e nota), vengono isolate dalle altre.

Isolamento con campi magnetici

3. Isolamento con campi magnetici

• Utilizzo di beads magnetici coperti da anticorpi.
• I beads magnetici a cui è legato un anticorpo sono mescolati alla sospensione di cellule, poi passati in materiale che lega i beads quando è posta in un campo magnetico.
• Le cellule marcate rimangono à intrappolate nella sostanza, mentre tutte le altre che NON esprimono l’antigene di membrana passano.
• Per raccogliere le cellule legate alle beads si toglie campo magnetico e si raccolgono.

Particolare isolamento dei linfociti CD4+ e CD25+ con beads magnetici

1. Selezione negativa togliendo tutto ciò che non esprime CD4+.
2. Selezione positiva tenendo tutto ciò che ha CD25+.

Caratterizzazione e valutazione specificità mediante

Viene esplorata con lo studio della proliferazione o della produzione di citochine indotta dall'antigene.

Proliferazione solo in presenza dell'antigene specifico – SOLO PER CELLULE CD4+ o

• Incorporazione di timidina tritiata (marcatore radioattivo) nel DNA.
• Incorporazione di Bromodeossiuridina nel DNA sintetizzato (Per misurare il DNA di nuova sintesi).

Nessuna proliferazione con antigene diverso o Controllo positivo: mitogeno (o anticorpo) (o lectina) anti CD3, indipendente dalla specificità o Verifica della specificità, proliferazione data dall' aggiunta di anticorpo anti- HLA. o

Test di citotossicità – PER CD8+ o

• Marcatura della cellula bersaglio con cromo radioattivo (o meglio fluorocromo non radioattivo PKH26-GL) (= cellula che verrà lisata da cellula citotossica).
• Unire cellule bersaglio e cellule citotossiche per farle interagire.
• Centrifugazione e misurazione del cromo radioattivo (metodo radioattivo) oppure misurazione del segnale fluorescente con citofluorimetro (per capire efficienza delle cellule citotossiche).

ELISA

Misura piccole quantità di ligando con una reazione colorimetrica. ELISA = enzyme linked immunosorbent assay.

Protocolli più frequenti:

• Analita che vogliamo misurare è un anticorpo contro un antigene adsorbito dalla fase solida.
• Analita è una molecola catturata da un anticorpo – ELISA sandwich.

Sistema eterogeneo indiretto non competitivo.

I test ELISA si svolgono attraverso diverse fasi:

Coating

A. COATING (A) coating = attacco di proteine ed altre biomolecole ad una à fase solida attraverso un processo di adsorbimento. Il supporto solido = piastra a 96 pozzetti. Substrato di polistirene molto idrofobico, per questo viene trattato con irradiazione o reazioni chimiche che consentono di formare legami covalenti con antigeni.

COATING → Attacco di proteine o altre biomolecole che attaccano la superficie per assorbimento o per legami covalenti. Il supporto solido è una piastra plastica di polistirene, la plastica utilizzata è critica. Dal tipo di supporto dipende la quantità di Ag che si lega e la capacità di legare altri componenti del test. Le piastre per lo più sono di polistirene, la superficie è idrofobica che potrà fare solo legami di tipo idrofobico. Hanno sviluppato strategie per modificare la superficie: irradiazione con raggi X, spezza anelli benzenici e si ha la liberazione di gruppi carbossilici liberi. Altra tecnica è aggiungere reattivi che creano legami covalenti.

In commercio avremo quindi 2 piastre:

• Medium binding → non grattare dove la superficie è idrofobica, immobilizzazione di grandi molecole.
• High binding → proteine si attaccano per legami idrofobici o ionici. La capacità di assorbimento è più alta (trattate con raggi laser) sui gruppi carbossilici sono state poste molecole linker che sono in grado di formare legami covalenti con l'antigene. Questo legame covalente gli permette di orientare la molecola su fase solida.

Le piastre sono da 96 pozzetti che possono avere dimensioni o forme diverse (piatte o rotonde). Il colore della piastra può essere trasparente o opaco.

• Aggiunta la proteina, quale tampone usiamo per il coating? Quando si tratta di proteine il pH da utilizzare è meglio che sia basico, quando abbiamo pezzi piccoli pH ottimali intorno a 7. pH basso per proteine, pH neutro per peptidi. Le cose si complicano con altri antigeni.
• Il volume che si usa per il coating è di 100 microlitri (50 microlitri se si vuole risparmiare) e la concentrazione giusta è un range che va da 1 a 10 microlitri/ml.
• Quanto tempo ci vuole per far sì che Ag si leghi alla piastra attraverso legami idrofobici, ioni litio? Il tempo dipende da temperatura, 1 ora a 37°C.

Saturazione

B. Saturazione (B) à per occupare tutto lo spazio lasciato libero dall’antigene per evitare legami con altre proteine. Si cerca agente saturante per evitare ciò (Ag non si lega tutto alla piastra). L'agente saturante può essere → ALBUMINA bovina, si può utilizzare anche caseina, gelatina o agente non ionico come tween 20. L'albumina serve nei tamponi a stabilizzare le proteine. Il volume di agente saturante deve essere uguale o poco minore di quello del coating per 30-60 minuti.

Diluizione del campione

C. Diluizione del campione stabilita sulla base del campione. Nei test acquistati la diluizione è già decisa e in à genere è 100. Il tampone di diluizione è neutro (fisiologica tamponata) e contiene un pochino di agente saturante e un pochino di detergente non ionico che aiuta ad evitare formazione di legami non specifici. Incubare 1 h a 37°C o 3-4 h a temperatura ambiente o overnight a 4 °C.

D. Incubazione

E. Lavaggi

Aggiunta anticorpo marcato

F. Aggiunta anticorpo marcato finita l'incubazione con siero si toglie tutto ciò che non è legato. La piastra si à svuota, si lava e si aggiunge Ab* marcato.

Come si sceglie Ab* e a che diluizione? Da comprare e diluire a seconda di ciò che impone il produttore. Si diluisce come abbiamo diluito il primo anticorpo (tampone neutro + agente saturante).

Gli enzimi utilizzati devono essere stabili, piccoli per legarsi ad Ab, deve essere semplice legarsi ad Ab. Queste caratteristiche sono tipiche di fosfatasi alcalina e perossidasi di rafano.

Poi si ha aggiunta di substrato per osservare il colore. Il substrato deve essere diluito al momento dell'uso.

Si ottiene alla fine un prodotto colorato, lo spettrofotometro leggerà il test alla lunghezza d'onda sul giallo.

Substrato

G. Substrato Esistono varianti con l'utilizzo di substrato fluorescente. In questo caso abbiamo bisogno di à macchinario che sappia leggere immunofluorescenza. Se si utilizza perossidasi come enzima e come substrato luminolo. Quando si ha lo sviluppo di colore, la reazione enzimatica continua in modo lineare. Nel caso di emissione di luce si ha una grande emissione e poi l'emissione dura per una ventina di minuti. Per la lettura si utilizza luminometro. Utilizzo di piastra bianche opache.

Come si esprimono i risultati di un test ELISA → nel test bisogna sempre utilizzare dei controlli per essere sicuri aver lavorato bene ovvero un controllo negativo e due positivi in due fasce diverse (positivo medio e uno alto per essere sicuri di misurare correttamente anticorpi a vari livelli) e per stabilire se un soggetto ha siero positivo o negativo bisogna stabilire il limite di norma (a partire da una popolazione di controlli negativi e media e 2-3 deviazioni standard) e un intervallo di riferimento; un test ELISA può essere quantitativo se viene espresso tramite una curva standard con un controllo positivo.