Laboratorio di microbiologia

Laboratorio di microbiologia

Caratteristiche morfologiche e tintoriali

Lo studio microscopico dei batteri può essere effettuato sia con esame a fresco (Fig. 1) o previa colorazione che serve per aumentare il contrasto durante l'osservazione al microscopio ottico.

Esame a fresco

Figura 1. Modalità di osservazione al microscopio ottico a fresco.

Previa colorazione

La colorazione permette di determinare più facilmente le dimensioni e la forma delle cellule colorate e di apprezzare alcune strutture cellulari. I coloranti sono composti organici contenenti dei radicali cromofori che producono colore e dei gruppi auxocromi salificanti. La maggior parte dei coloranti sono sali, ma vengono chiamati basici se la porzione colorata si comporta come una base, o coloranti acidi se si comporta come un acido.

Prima della colorazione i batteri sono generalmente sospesi in acqua o in altro liquido e distesi su un vetrino ben pulito in modo da formare uno strato sottile e uniforme. Dopo essiccamento all'aria, i microrganismi sono fissati chimicamente o più comunemente al calore, passando rapidamente il vetrino sulla fiamma (Fig. 2).

Tecniche di colorazione

• Colorazioni semplici - Rendono le cellule meglio evidenziabili all'osservazione microscopica. Richiedono l'uso di un solo colorante (es. blu di metilene, cristalvioletto, fucsina basica). La colorazione semplice è utilizzata per la valutazione della forma, della disposizione e delle dimensioni dei batteri, non consente però di evidenziare i dettagli della struttura interna. Figura 2. Allestimento di un vetrino per la colorazione.

Colorazione con blu di metilene

È una colorazione semplice che mette in evidenza la presenza di microrganismi in un materiale.

• Materiale occorrente:
• Blu di metilene 0,5 g
• Soluzione all'1% di KOH 1 ml
• Alcool etilico 30 ml
• Acqua distillata 100 ml
• Allestimento del preparato come di norma. Aggiungere 1 - 2 gocce della soluzione di blu di metilene e lasciare agire 30 - 60", lavare con acqua e osservare al M.O. Le cellule sono colorate in blu.

• Colorazioni complesse - Richiedono l'uso di più coloranti. Mettono in evidenza non solo la morfologia, ma anche determinate caratteristiche di gruppi di microrganismi (colorazioni differenziali).

Le colorazioni differenziali utilizzano due coloranti, di cui il primo si chiama primario; il differenziamento si ottiene applicando una soluzione che allontana il colorante primario da alcune cellule o strutture; il secondo colorante che colora le cellule decolorate si chiama colorante secondario o di contrasto. Le colorazioni differenziali sono largamente impiegate nell'identificazione dei batteri.

Colorazione di Gram

Una delle colorazioni differenziali più comuni è la colorazione di Gram. È stata sviluppata nel 1884 dal medico danese Hans Christian Gram allo scopo di distinguere i batteri responsabili delle forme polmonari dai nuclei delle cellule dei tessuti infetti. Egli non fu soddisfatto dal metodo in quanto non tutti i batteri si coloravano. Quello che Gram considerò un difetto costituisce la base della metodica attuale. Sulla base di questa colorazione, i batteri si possono dividere in due gruppi principali, Gram-positivi e Gram-negativi. In seguito alla colorazione i batteri Gram-positivi si colorano in blu-violetto, mentre i Gram-negativi si colorano in rosso. Il diverso comportamento dei due gruppi di batteri è dovuto alla differente composizione della parete cellulare.

Materiale per la colorazione di Gram

• Cristalvioletto o violetto di genziana o violetto di Nicolle (Cristalvioletto fenicato all'1%)
• Soluzione di Gram o iodio iodurata o Lugol (Iodio 1 g, ioduro di potassio 2 g, in H₂O distillata 100 ml)
• Alcool etilico al 95% o acetone (meno usato)
• Safranina (soluzione acquosa allo 0.5%)

Sul vetrino opportunamente allestito vengono versate alcune gocce del colorante primario filtrato con carta da filtro per evitare la presenza di cristalli (N.B. l'acido fenico presente nel colorante funge da mordenzante facendolo penetrare meglio all'interno della cellula), si lascia agire per 2-3', si getta l'eccesso di colore e si versa la soluzione di Lugol lasciandola agire per 2-3', si toglie l'eccesso di Lugol e si versa l'alcool assoluto per allontanare il colorante non trattenuto dalle cellule (N.B. la decolorazione è il momento critico della colorazione di Gram perché un trattamento con alcool troppo prolungato potrebbe decolorare anche le cellule Gram +!!!), si lava con acqua di fonte e si copre il preparato con Safranina, lasciandola per 5-8'; si elimina l'eccesso di Safranina, si lava con acqua di fonte e si fa asciugare il vetrino ponendolo in termostato per 10-15'. Si osserva al M.O. Le cellule Gram positive sono colorate in violetto perché hanno trattenuto il colorante primario; le cellule Gram negative sono colorate con il colorante secondario rosso perché sono state decolorate con il trattamento con l'alcool.

Protocollo schematico 2. Colorazione di Gram

• Allestimento del preparato
• a) Versare sul preparato il cristalvioletto e lasciare agire per circa 2-3'
• b) Togliere il colorante in eccesso, senza sciacquare
• c) Versare il liquido di Lugol e lasciare per 1-2'
• d) Decolorare con alcool per circa 30'', lavare con acqua di fonte
• e) Colorare con la safranina per 5-10'
• f) Sciacquare con acqua di fonte e asciugare
• g) Osservare il preparato colorato al M.O. con un obiettivo ad immersione

Altre colorazioni per la microscopia ottica

Colorazione della capsula

La capsula batterica può essere messa in evidenza sia utilizzando colorazioni positive che colorano la capsula in modo specifico sia colorazioni negative che colorano il campo circostante lasciando incolore la capsula. La colorazione negativa viene preferita perché i coloranti specifici possono alterare i costituenti della capsula.

a) Colorazione negativa con inchiostro di china o nigrosina

• Inchiostro di china o nigrosina diluiti
• Fucsina

Si stempera la patina batterica in una goccia d'inchiostro di china, anziché di acqua, si lascia asciugare e quindi si fissa al calore. Si colora la cellula con il colorante di contrasto. Al microscopio ottico la capsula appare come una zona non colorata fra il corpo batterico rosso e lo sfondo nero. Il materiale capsulare prende difficilmente il colore.

b) In alternativa

Ad una goccia di inchiostro di china si aggiunge una goccia di sospensione cellulare. Si copre con un vetrino coprioggetti, si schiaccia leggermente e si osserva al M.O. La capsula apparirà come un alone chiaro intorno alla cellula su un fondo scuro.

Colorazione della guaina mucillaginosa

La colorazione della guaina mucillaginosa può essere fatta analogamente che per la capsula con una colorazione negativa utilizzando il rosso Congo. Il rosso Congo può essere utilizzato per una colorazione complessa:

• Soluzione 10mM di cetil-piridin cloruro
• Fissativo di Bouin
• Miscela 2:1 di soluzione satura di rosso Congo e Tween 80 al 10%
• Fucsina carbolica al 10%

I vetrini su cui è stata precedentemente distribuita una sospensione di cellule sono ricoperti con la soluzione di cetil-piridin cloruro ed asciugati all'aria per 20-30', quindi fissati con fissativo di Bouin per 4'. Sciacquati e colorati per 20' con una miscela 2:1 di soluzione satura di rosso Congo e Tween 80 al 10%. Di seguito per 30'' con fucsina carbolica al 10%, sciacquati ed asciugati a 37°C. Il sale d'ammonio quaternario precipita i polisaccaridi che vengono colorati dal rosso Congo, la cui colorazione è intensificata dal Tween, le cellule sono colorate in rosso dalla fucsina.