Istologia

Obiettivi e programma di istologia

1. Saper riconoscere e descrivere dal punto di vista strutturale le principali parti della cellula, assegnando a ciascuna componente la sua specifica funzione.
2. Aver compreso il concetto di “differenziamento cellulare” ed essere in grado di correlare le differenze morfologiche con le rispettive attività funzionali.
3. Saper riconoscere e descrivere i tessuti dell’organismo umano, evidenziando il rapporto tra aspetto morfologico e significato funzionale.
4. Saper raccordare la distribuzione dei tessuti nelle varie strutture del corpo umano, come propedeutica allo studio dell’anatomia microscopica.

Premessa sulle tecniche istologiche

Premessa sulle tecniche istologiche di base allo scopo di saper interpretare le immagini proposte durante il corso. Dimensione di cellule e tessuti; concetto di limite di risoluzione (LR): LR dell’occhio umano, del microscopio luce (ML) e del microscopio elettronico (ME). Allestimento di un preparato stabile, con particolare riferimento all'importanza di una corretta fissazione di cellule e tessuti. Colorazione con ematossilina/eosina (concetto di acidofilia e basofilia).

Citologia

Citologia. Cenni sul differenziamento cellulare. Struttura e significato funzionale della membrana plasmatica (permeabilità, endocitosi ed esocitosi, recettori). Struttura del nucleo, del nucleolo e dell’involucro nucleare. Struttura e correlati funzionali degli organuli citoplasmatici (reticolo endoplasmatico liscio e granulare, ribosomi, complesso di Golgi, lisosomi, mitocondri, citoscheletro e centriolo).

Istologia: il tessuto epiteliale

Istologia. Il tessuto epiteliale (TE). Caratteristiche del TE, suoi rapporti col T connettivo, classificazione in base alle diverse funzioni. Epiteli di rivestimento: classificazione ed esempi di distribuzione anatomica. Giunzioni cellulari (desmosomi, giunzioni serrate e giunzioni occludenti), ciglia vibratili, microvilli. Epiteli ghiandolari, origine, caratteri generali di struttura delle ghiandole esocrine e di quelle endocrine, con riferimenti anatomici.

Il tessuto connettivo

Il tessuto connettivo (TC). Origine e organizzazione generale dei tessuti trofo-connettivali. TC propriamente detto: i tipi cellulari, la matrice extracellulare (fibre e sostanza fondamentale); classificazione e distribuzione anatomica dei diversi tipi. Cenni sul tessuto adiposo bianco e bruno. Tessuto cartilagineo: i tipi cellulari, la matrice cartilaginea; classificazione e distribuzione anatomica delle cartilagini. Pericondrio. Tessuto osseo: caratteristiche e distribuzione dell’osso compatto e spugnoso; i tipi cellulari, la matrice ossea; il rimaneggiamento osseo. Lamella ossea. Periostio. Cenni sui processi di ossificazione. Sangue: il plasma, gli elementi figurati (morfologia al ML e al ME e cenni sul loro significato funzionale). Formula leucocitaria.

Tessuto muscolare e tessuto nervoso

Tessuto muscolare (TM). Generalità e classificazione. Tessuto muscolare striato scheletrico: struttura dei muscoli inseriti sullo scheletro. Fibra muscolare striata scheletrica: morfologia al ML e al ME; origine e rapporti con il TC, sarcolemma e sarcoplasma. Fibre rosse e fibre bianche. Il sarcomero, miofilamenti spessi e sottili. La triade come sede dell’accoppiamento fra impulso nervoso e contrazione muscolare. Tessuto muscolare liscio: organizzazione e localizzazione anatomica; la fibrocellula muscolare, morfologia al ML e al ME. Muscolatura multiunitaria e viscerale; movimenti peristaltici. Tessuto muscolare striato cardiaco: aspetto delle cellule muscolari striate cardiache al ML e al ME; tratti scalariformi.

Tessuto nervoso. Il neurone: caratteristiche morfologiche, strutturali ed ultrastrutturali; cenni istofisiologici sulle funzioni caratteristiche (eccitabilità e conducibilità). Basi morfologiche della trasmissione dell’impulso nervoso, sinapsi nervose e neuromuscolari. Classificazione istologica e funzionale dei neuroni con riferimenti anatomici. Fibra nervosa e nervo. Cellule gliali.

Argomenti principali

1. Tessuti epiteliali di rivestimento
2. Tessuti epiteliali ghiandolari
3. Tessuto connettivo
4. Sangue
5. Tessuto osseo
6. Cartilagine
7. Tessuto muscolare
8. Tessuto nervoso

Introduzione

Istologia = studio dei tessuti.

Organizzazione biologica: atomi → molecole → organuli → cellule → tessuti → organi → apparati.

Tessuto = insieme/associazione di cellule; insieme di cellule che hanno stessa origine e funzione (es. cellule dell’epidermide derivano tutti dallo stesso foglietto embrionale, l’epiblasto, e hanno la stessa funzione, quella di difesa) ma non è necessario che abbiano la stessa forma.

I 4 tessuti fondamentali del nostro corpo:

1. Tessuto epiteliale
2. Tessuto connettivo
3. Tessuto muscolare
4. Tessuto nervoso

Limite di risoluzione

Limite di risoluzione: distanza minima tra 2 punti vicini percepibili come distinti.

Dell’occhio umano il limite di risoluzione è vicino al 1/10 mm (0,1 mm).

Anche i microscopi hanno limiti di risoluzione (microscopio luce: a colori; microscopio elettronico: in bianco e nero ← parti del preparato + dense che deviano maggiormente gli elettroni).

Microscopio luce. Il limite del microscopio luce è di 0,2 µm, al di sotto di questa soglia si deve usare il microscopio elettronico che utilizza un fascio di elettroni che viene accelerato sottovuoto. Una volta inserito il campione da osservare, gli elettroni vengono deviati dai punti del preparato, scontrandosi con il preparato gli elettroni proiettano su uno schermo fluorescente un cono d’ombra. Quindi al microscopio elettronico si vedrà in bianco e nero. Il limite di risoluzione del microscopio elettronico è di 0,4 nm.

Limiti di risoluzione: occhio umano 0,1 mm (1/10 mm); microscopio luce 0,2 µm (200 nm); microscopio elettronico circa 0,4 nm.

Potere risolutivo: determina il livello di dettaglio contenuto nell’immagine. L’ingrandimento non determina un aumento di risoluzione delle immagini (quando zoomo sempre di più una foto fino a che non vedo tutto sgranato e pixelloso).

Microscopio crioelettronico (crio microscopio elettronico): migliora del doppio le capacità di risoluzione.

SEM: microscopio a scansione elettronica.

1 µm (micron o micrometro) = 1/1000 mm per le dimensioni cellulari.

1 nm (nanometro) = 1/1000 µm per le dimensioni subcellulari (es. organuli e virus).

Come fissare un tessuto

Per osservare al microscopio luce i campioni devono essere molto sottili. Per evitare artefatti è necessario fissare un tessuto: bloccare (uccidere consapevolmente) ogni attività vitale delle cellule del tessuto, compresi gli enzimi autolitici che vanno a degradare la cellula dopo la morte ⇒ mantenere la cellula come se fosse allo stato vitale, altrimenti si degrada.

I fissativi:

• Agenti chimici liquidi: si immerge il campione nel fissatore. Si usa la formalina/formaldeide (è il fissatore più diffuso) che provoca formazione di legami incrociati tra le molecole proteiche, ciò inattiva la struttura terziaria degli enzimi autolitici.
• Molto usato anche l’alcol (è un buon fissatore perché assorbe l’H2O e blocca gli enzimi autolitici), entra nella cellula e si sostituisce all’acqua disidratandola (ha come effetto collaterale la restrizione della cellula e altera lievemente la morfologia).
• Agenti fisici → congelamento: deve essere istantaneo.
• Getto di CO2 (-75 gradi).
• Azoto liquido (-195 gradi).

Il congelamento è preferito quando serve una risposta rapida (es. durante un’operazione e serve biopsia).

Non esiste il fissatore migliore, ma è necessario che la fissazione avvenga velocemente perché il tessuto deteriora in pochi secondi.

Per la preparazione del materiale istologico sono necessari strumenti particolari: i microtomi (tipo affettatrice). Prima del taglio il tessuto deve essere indurito mediante inclusione (= infiltrare il tessuto con una sostanza inizialmente liquida che poi solidifica indurendo anche il tessuto ← paraffina/cera fusa), questo è necessario perché i tessuti sono in genere molli ed è difficile tagliarli in modo uniforme (es. è difficile tagliare in modo uniforme un muscolo - carne). È possibile anche congelare il tessuto prima di effettuare il taglio.

Fissazione → inclusione → taglio col microtomo → colorazione.

Coloranti istologici

I tessuti sono normalmente incolori e senza contrasto, vanno quindi colorati mediante i coloranti istologici, i quali possono essere:

• Basici → ematossilina (colorante basico, blu/viola) ← per le sostanze acide, basofile.
• Acidi → eosina (colorante acido, rosso/rosa) ← per le sostanze basiche, acidofile.

Sistema di colorazione ematossilina-eosina: prima si immerge il campione nell’ematossilina, poi lo si lava e lo si immerge in eosina.

Acidofilia = le sostanze basiche che si trovano nei tessuti possiedono affinità per i coloranti acidi (rosso).

Basofilia = le sostanze acide che hanno affinità con i basici (viola).

• Il DNA (acido desossiribonucleico) è acido, quindi è basofilo e avrà affinità con i coloranti basofili viola/blu (ematossilina). Stessa cosa RNA.
• La maggior parte delle proteine sono basiche e quindi acidofile (si colorano di rosso).
• Alcune sostanze non si colorano né di rosso né di blu, queste sono i lipidi e i glucidi (non si colorano nei comuni preparati con ematossilina ed eosina).

In un comune preparato:

• Nucleo basofilo ed eucromatico (chiaro e vescicoloso).
• Citoplasma basofilo: i ribosomi stanno sintetizzando proteine (l’RNA fa sì che sia basofilo).
• Nucleolo visibile.

Istochimica: sono colorazioni specifiche del protoplasma (= complesso di proteine, lipidi, polisaccaridi e DNA) consente l’identificazione in situ dei costituenti chimici di cellule e tessuti mediante specifiche reazioni di colorazione.

Immunoistochimica: quando si utilizzano degli anticorpi diretti in maniera specifica a degli antigeni tissutali, lo scopo è quello di rendere visibile gli antigeni tramite dei marcatori (fluorescenti o enzimatici).

Citologia

Teoria cellulare (1839 Schwann):

1. La cellula è l’unità strutturale e funzionale di ogni organismo vivente;
2. Ogni cellula ha origine da un’altra cellula;
3. La cellula è la più piccola struttura capace di vita autonoma.

Le cellule hanno varie forme e dimensioni (e anche diverse specializzazioni – microvilli/cellula intestinale: assorbimento, cellula muscolare: contrattilità; cellula nervosa/neurone: propagazione impulsi nervosi…).

Le dimensioni vanno dai 4 ai 150 µm.

La forma è l’immagine plastica della funzione, in base alla funzione da svolgere la cellula avrà una determinata forma (e viceversa).

Differenziamento cellulare: attivazione di geni specifici (alla funzione della cellula).

L’embrione è fatto da cellule tutte uguali; ad un certo punto nelle cellule che sono destinate a diventare cellule muscolari (ad esempio) vengono attivati i geni per i filamenti contrattili e la cellula inizia a prendere una forma allungata; nelle cellule destinate a diventare neuroni si accendono determinati geni per la conduzione nervosa e inizia a prendere la classica forma stellata.

In tutte le cellule il corredo genetico è lo stesso, cambiano i geni che vengono attivati (in una cellula muscolare saranno attivi geni che in un neurone sono “spenti”, ma questo non significa che la cellula muscolare non abbia lo stesso corredo genetico del neurone).

Il differenziamento è inversamente proporzionale alla capacità di una cellula di adattarsi; tanto più una cellula è differenziata tanto meno potenzialità divisionale possiede (cellule dell’embrione hanno differenziamento 0 poi a partire da 4-8 blastomeri inizia il differenziamento, queste sono cellule totipotenti che possono diventare “ciò che vogliono” fino a quando non prendono una direzione e si specializzano in un’unica funzione, a questo punto non potranno più adattarsi a nuove funzionalità ma saranno estremamente specializzate nel loro compito). Più una cellula è differenziata più c’è perdita di propensione mitotica (non si differenzia più o tende a non farlo) ← cellule poco differenziate in un tumore sono molto più aggressive e molto proliferanti rispetto a tumori con cellule differenziate.

Cellula eucariotica

È formata da 3 strutture fondamentali: membrana plasmatica, nucleo e citoplasma.

Membrana plasmatica

Detta anche membrana cellulare o plasmalemma. Circonda le cellule, è una sorta di involucro che circonda la cellula.

Ha uno spessore di 8 nm (non si vede al microscopio ottico, LR 0,2 µm).

Ha una composizione biochimica di tipo lipoglicoproteica:

• Parte lipidica: fosfolipidi; molecole con testa idrofila (polare) e code idrofobiche (apolari) che spontaneamente si posizionano in un doppio strato con le teste posizionate esternamente verso gli ambienti extra ed intracellulare e le code internamente le une rivolte verso le altre.
• Parte glucidica: gli zuccheri sono legati in maniera covalente alle proteine o, molto più raramente, anche ai fosfolipidi. Sono esclusivamente sul versante extracellulare e formano nel loro insieme il glico calice (insieme degli zuccheri della membrana, sul lato esterno). La funzione del calice è inerente al riconoscimento delle cellule, fungono da recettori e trasmettitori di segnale antigeni di superficie (detti quelli presenti sui globuli rossi determinano un gruppo sanguigno piuttosto che un altro). Alcuni antigeni sono comuni alla specie umana mentre altri sono specifici di ciascuno individuo, tali da determinare un rigetto in caso di trapianto eterologo (tra individui diversi).
• Parte proteica: possono contrarre diverse tipologie di rapporto con il doppio strato fosfolipidico. Possono essere appoggiate sul versante interno oppure esterno della cellula e in questo caso si chiamano proteine estrinseche di membrana. Oppure possono essere profondamente inserite nel doppio strato (proteine intrinseche o integrali) o possono attraversarlo da parte a parte (proteine transmembrana).

La membrana cellulare è definita come modello a “mosaico fluido in movimento” perché a 37 gradi (temperatura corporea) i fosfolipidi non sono solidi ma fluidi; infatti, le proteine possono muoversi con una certa libertà (presenza anche di zattere lipidiche).

Il feltro proteico (diverso in ciascun tipo cellulare ma presente in quasi tutte le cellule) è una sorta di rete/strato di proteine che si trova sul versante intracellulare e ancora le proteine di membrana. Per esempio, nel caso del globulo rosso, il feltro proteico è fatto da spettrina. Questa dona al globulo la sua caratteristica forma a disco biconcavo (ha significato funzionale) e la sua plasticità (capacità di schiacciarsi/deformarsi in capillari più piccoli di quella che è la sua dimensione, 7,5 µm, e ritornare alla forma originale).

Il feltro nelle cellule muscolari è caratterizzato dalla distrofina, la quale aggancia i filamenti contrattili della cellula muscolare e li aggancia alla membrana, in questo modo quando le fibre si contraggono la membrana segue precisamente i movimenti. Nei distrofici (distrofia muscolare), nei quali la distrofina è mutata, la membrana si deteriora fino a rompersi e questo causa la morte cellulare delle cellule muscolari e queste vengono sostituite da tessuto cicatriziale (robusto ma per niente contrattile e il muscolo perde quindi la capacità contrattile).

Le sostanze che possono attraversare la membrana secondo gradiente di concentrazione (possono diffondere liberamente) sono solo acqua (passano attraverso le acquaporine quindi in realtà non attraversano realmente la membrana), gas respiratori (rendono molto veloce lo scambio di ossigeno tra sangue e cellule) e molecole liposolubili (es. gli ormoni liposolubili passano la membrana tranquillamente e spesso i recettori sono dentro la cellula, quelli di natura proteica non possono in nessun modo attraversare la membrana e i loro recettori sono esterni infatti).

Per tutte le altre sostanze ci sono delle proteine canale (che sono proteine transmembrana) con foro molto sottile tramite il quale possono passare gli ioni (o comunque molecole molto piccole) secondo il loro gradiente di concentrazione.

Le proteine canale sono in genere molto specifiche, è raro trovare canali sempre aperti infatti esiste un meccanismo di controllo per l’apertura:

• A controllo di ligando: si aprono in seguito al legame con una specifica molecola (neuroni, sinapsi chimica con neurotrasmettitori);
• A controllo di voltaggio (o di potenziale): quando la differenza di potenziale raggiunge un determinato valore (neuroni, sinapsi elettrica);
• A controllo meccanico: si aprono a seguito di una stimolazione meccanica del canale (orecchio interno, stereociglia stimolate da onde sonore).

Ci sono anche dei veri e propri trasportatori di membrana detti carrier (o permeasi). Questi subiscono una modificazione conformazionale in base ai legami con determinate molecole (per esempio, all’inizio è aperto fuori e dopo il legame con la molecola si “ribaltano” e si aprono dall’altra parte). Possono fare il trasporto passivo (senza ATP, secondo gradiente) oppure anche contro gradiente e quindi trasporto attivo (ATP). Quelli che eseguono il trasporto attivo sono detti pompe di membrana.

Una delle pompe più importanti è quella sodio-potassio: vengono portati fuori 3 ioni di sodio e sono immessi 2 ioni potassio (accumulo di potassio dentro e accumulo di sodio fuori). Il potassio (positivo) tende ad uscire dalla cellula (canali di fuga del potassio sulla membrana) e ciò rende l’interno della cellula negativo (-70 mV di equilibrio di potenziale).

La membrana è una struttura estremamente dinamica. Il fenomeno dell’endocitosi permette di far entrare corpi estranei all’interno della cellula (il corpo estraneo si appoggia alla membrana, vengono attivati dei