Immunodiagnostica e tecniche di laboratorio: ELISA e citofluorimetria a flusso

Immunodiagnostica

Sierologia definizione

La sierologia è un importante strumento diagnostico per molteplici patologie come le malattie autoimmunitarie e infettive.

L'interazione tra antigene e anticorpo si verifica in vivo o in laboratorio e fornisce le basi per i test sierologici.

Le IgM e IgG

• IgM sono le immunoglobuline principali nelle risposte immunitarie primarie.
• Vengono rimpiazzate da anticorpi di differenti isotopi principali IgG nel siero.
• Tuttavia sono prodotte occasionalmente a basso titolo nel corso di infezioni secondarie e nella fase tardiva del processo infettivo primario.
• Esse sono sempre prodotte da cellule che incontrano l'Ag per la prima volta.
• Sono estremamente importanti nella diagnosi di infezioni recenti nel feto e neonato.
• Quando un feto produce IgM specifiche per un virus, come quello della rosolia, vuol dire che è stato infettato dal virus, in quanto le IgM non attraversano la placenta.

Perciò l'unico modo per un feto di produrre IgM specifiche per un determinato patogeno è contrarre l'infezione.

Successivamente alla risposta IgM, le immunoglobuline prodotte sono di classe IgG.

Definizioni

• Idiotipo è la base unica creata dalle regioni variabili della catena leggera e pesante. Rappresenta la regione che è specifica per l'antigene.
• Isotipo di un anticorpo è determinato dalla regione costante delle catene pesanti. Ne caratterizza la funzione.
• Allotipo di un anticorpo è una differenza allelica dello stesso anticorpo nella popolazione.

Immunodiagnostica

Sierologia definizione

È un importante strumento diagnostico per molteplici patologie come le malattie autoimmunitarie infettive.

Immunochimica

Studia ➔ Ag ➔ anticorpi.

L'interazione tra antigene e anticorpo si verifica in vivo o in laboratorio e fornisce le basi per i test sierologici.

Le IgM e IgG

• IgM sono le immunoglobuline principali nelle risposte immunitarie primarie.
• Vengono rimpiazzate da anticorpi di differenti isotipi, principalmente IgG nel siero.
• Sebbene siano prodotte occasionalmente a basso titolo nel corso di infezioni secondarie nella fase tardiva del processo infettivo primario, esse sono sempre prodotte da cellule che incontrano l'Ag per la prima volta.
• Sono estremamente importanti nella diagnosi di infezioni recenti nel feto e neonato.

Pertanto l'unico modo per un feto di produrre IgM specifiche per un determinato patogeno è contrarre l'infezione.

Successivamente alla risposta IgM, le immunoglobuline prodotte sono di classe IgG.

Definizioni

• Idiotipo è la base unica creata dalle regioni variabili della catena leggera e pesante. Rappresenta la regione che è specifica per l'antigene.
• Isotipo di un anticorpo è determinato dalla regione costante delle catene pesanti. Ne caratterizza la funzione.
• Allotipo di un anticorpo è una differenza allelica dello stesso anticorpo nella popolazione.

Gli anticorpi monoclonali e policlonali

• Un antisiero policlonale è generalmente prodotto da un individuo durante qualsiasi tipo di infezione.
• È costituito da molteplici cloni di cellule B che producono anticorpi verso diversi epitopi di un antigene.
• Gli anticorpi monoclonali sono prodotti da un singolo clone di cellule B specifiche per lo stesso identico epitopo di un antigene.
• Sono prodotti in laboratorio.
• Utilizzati nella medicina.
• Dalla diagnostica al trattamento di vari tipi di neoplasie o malattie autoimmunitarie.

Test sierologici diretti ed indiretti

Diretti

• Utilizzano un antisiero conosciuto al fine di rilevare un antigene sconosciuto.
• Sono rapidi.
• Utilizzati per finalità di screening.

Indiretti

• Utilizzano anticorpi del paziente.
• Possono essere specifici per un autoantigene.
• Alloantigene.
• Possono essere qualitativi, usati in screening.
• Quantitativi, che indicano il quantitativo di anticorpi nel siero del paziente.
• Un titolo viene eseguito per monitorare la progressione di uno stato patologico valutando l'incremento o la riduzione.
• Per valutare il titolo, il siero del paziente viene "diluito" per quantificare la diluizione alla quale è ancora possibile rilevare l'antigene.
• Sono in genere più specifici con minor numero di falsi.

Esempi di test che possono essere eseguiti con entrambe le metodiche sono:

• Test di Coombs.
• ELISA.
• Immunofluorescenza.

Tecniche di laboratorio

Sono di uso comune sia nella ricerca che nella diagnosi di patologie.

Usano gli anticorpi monoclonali che riconoscono con elevata affinità un antigene specifico.

Alcuni marcati permetteranno infine di rilevare l'interazione antigene-anticorpo.

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

Saggio di assorbimento immuno-enzimatico

Generalità: prevede l'uso di un enzima, es. fosfatasi alcalina, perossidasi, coniugato su anticorpo monoclonale: l'addizione di un substrato ne causa la trasformazione in un prodotto colorato, che permetterà di quantificare il reagente legato.

Indirettamente all'enzima permette lettura con apposito spettrofotometro, e di risalire alla stima dell'analita in esame.

Analita → sostanza disciolta in soluzione e [ ] ignota.

Test diretto a sandwich

Si rileva la presenza dell'Ag, es. diagnostica virologica nel sangue.

1. Si pone il primo anticorpo purificato, adsorbito e legato sulle piastrine del piascaro di microtitolazione, piastra a 96 pozzetti.
2. Aggiunta del campione biologico, plasma o sera, e quindi di sostanze alla quale si deve valutare la presenza e concentrazione dell'antigene, analita incognito, e legame antigene-anticorpo.
3. Lavaggio con soluzione tampone e rimozione dell'antigene in eccesso, non legato.
4. Aggiunta dell'anticorpo secondario → che lega un epitopo diverso dello stesso antigene.

Questo anticorpo monoclonale è marcato da un enzima, epitopo non sovrapposti.

5. Lavaggio con soluzione tampone e rimozione dell'anticorpo in eccesso, non legato.
6. Determinazione della quantità del secondo anticorpo che si è legato in funzione della concentrazione di antigene aggiunto.

Curva di taratura, o standard, in base all'intensità della colorazione che deriva dalla reazione enzimatica.

Test indiretto

Si rileva la presenza di anticorpi contro antigeni. Es.: rilevazione anticorpi contro HIV.

1. L'antigene purificato, specifico per l'anticorpo ricercato, viene fissato sulla superficie di una piastra di microtitolazione, fissazione elettrostatica, lavaggio dell'eccesso.
2. Aggiunta del campione biologico da dosare, che contiene gli anticorpi da quantificare. Legame antigene-anticorpo, lavaggio dell'eccesso.
3. Aggiunta altri anticorpi di rivelazione coniugati con un enzima, la cui ossidazione determina la reazione colorimetrica.

Questo anticorpo secondario → è un anti-IgG e anti-IgM.

Rivelazione e costruzione di una curva standard, o di taratura.

Strumenti di interpretazione del risultato

Lo spettrofotometro

Lo spettrofotometro → strumento di misura della radiazione luminosa.

È il lettore della piastra e della reazione colorimetrica.

Esso è costituito da:

• Sorgente di luce, lampada → a tungsteno emette radiazione a varie λ.
• Filtro monocromatore → seleziona una specifica lunghezza d'onda incidente che attraversa la soluzione col campione.
• Parte di tale luce verrà assorbita e parte verrà emessa come luce trasmessa e, misurata con un rilevatore analogico-digitale, la differenza tra radiazione incidente e radiazione trasmessa.

Si ottiene l'assorbanza, u.m. densità ottica, direttamente proporzionale alla concentrazione della sostanza esaminata.

Si può costruire, infine, una curva di taratura, o standard: ogni punto della curva è a concentrazione nota e l'equazione che descrive la curva permette di calcolare la quantità di analita presente nel campione di indagine.

Citofluorimetria a flusso

Permette di analizzare rapidamente citotipi in sospensioni cellulari.

Il citofluorimetro è uno strumento che permette il collettivo di popolazioni cellulari in sospensione, rendendo possibile la misurazione di proprietà multiple di singole cellule molto rapidamente.

Possibili applicazioni

Permettono la caratterizzazione multiparametrica del campione.

I fluorocromi, es. fluorescina, sono molecole fluorescenti eccitate da una fonte luminosa monocromatica, raggio laser.

Il fluorocromo assorbe tale energia e la rilascia sotto forma di fotoni a una lunghezza d'onda maggiore.

• Identificazione di Ag di membrana e intracellulare nelle cellule in sospensione in base alla presenza di uno o più marcatori fluorescenti identificazione citotipi, immunofenotipo.
• Isolazione componenti contenenti diversi tipi cellulari sulla base di proprietà fisiche e morfologiche, diametro, volume, granularità.
• Determinazione dello stadio differenziativo, stadio di maturazione e stato di attivazione.
• Valutazione del contenuto cellulare di DNA, ciclo cellulare.
• Stima della vitalità di una cellula.

Principi di funzionamento

Il citofluorimetro è costituito da:

• Sistema fluido.
• Parte ottica.
• Sistema elettronico.

Sistema fluidico focalizzazione idrodinamica

La sospensione cellulare viene iniettata in una campana di flusso dove le cellule passano in maniera ordinata e separata avvolte da un fluido.

Qui interagiscono in raggio laser e la cellula emette segnali di luce diffusa in base alle proprie caratteristiche fisiche morfologiche.

Per fenomeni di:

• Rifrazione.
• Riflessione.
• Diffrazione.

Parte ottica

Attraverso un sistema di filtri e lenti le onde emesse verranno indirizzate verso i sensori dello strumento parametrando la rilevazione.

I fotomoltiplicatori trasformano i segnali luminosi in impulsi elettrici direttamente proporzionali alla luce raccolta.

Sistema elettronico

Infine, un computer collegato allo strumento provvederà a tradurre i segnali in grafica sulla loro rappresentazione su un display.

Tutto quello precedente è dovuto a fenomeni di emissione di fluorescenza dai citotipi marcatori.

In realtà, il raggio laser viene in larga parte disperso: light scattering:

• Nella direzione del flusso, forward scatter, [granularità/complessità cellulare].
• A 90° side scatter, [rapporto nucleo/citoplasma, diversione].

Esempio di citogramma

Esempio: campione sangue in citogramma: ha come assi FSC e SSC e permette di discriminare tra popolazioni cellulari basandosi solamente sulle loro caratteristiche fisiche.

SS(Y) e FS(X).

• Dimensioni.
• Monociti.
• Granulociti.
• In senso crescente.

Rappresentazione grafica emissione di fluorescenza

Questi tipi di rappresentazione devono tenere conto dell'autofluorescenza spontanea di cellule non marcate, obbligato termine di paragone di ogni marcatura cellulare.

Istogramma

La distribuzione con cui le cellule sono separate e l'intensità del segnale danno la conferma della positività per un determinato Ag e fornisce anche una definizione statistica.

Dot plot

Valutazione dei parametri di fluorescenza in un grafico bidimensionale che permette di valutare la presenza di un singolo marcatore o di 2 contemporaneamente.

Ogni punto riflette il passaggio di una cellula con una determinata 'intensità di fluorescenza'.

Il dot-plot può anche essere rappresentato come:

• Scatter-plot.
• Density-plot.
• Pseudo color-plot.

Esempio di applicazione immunofenotipo

SP₁ DP DN SP₂.

I linfociti:

• T CD8⁺ (CD8/CD4) -> DN.
• T CD4⁺ naive (CD45RA/CD45RO) -> SP₁.
• T CD4⁺ memory (CD45RA/CD45RO) -> SP₂.
• T helper follicolari (CXCR5/CD45RO) -> DP.
• T CD8⁺ naive (CD28/CD27) -> DP.
• T CD8⁺ early effector (CD28/CD27) -> SP₂.
• T CD8⁺ late effector (CD28/CD27) -> DN.

Schema più comprensibile:

• CD3⁺ CD4⁺ -> T CD4⁺.
• CD3⁺ CD8⁺ -> T CD8⁺.
• CD3⁺ CD4^- CD8^- -> T non convenzionali.
• CD19⁺ CD20⁺ -> B.
• CD16⁺ CD56⁺ -> NK.

Gli anticorpi usati dichiarano anti-, es. anti-CD3.