Grafici di Fisiologia generale

GRAFICI FISIOLOGIA GENERALE

15 righe / 350 parole

1. ESPERIMENTO DI GORTER E GRENDEL (1925)

Nel 1925, Gorter e Grendel condussero un esperimento fondamentale per

dimostrare che la membrana cellulare è costituita da un doppio strato di

fosfolipidi. Utilizzarono eritrociti (globuli rossi) poiché sono cellule prive di

organuli con membrana, quindi ideali per analizzare esclusivamente la

membrana plasmatica.

L’esperimento si basava su un’ipotesi semplice ma efficace: se la membrana

fosfolipidico, allora l’area totale occupata

fosse composta da un doppio strato

dai lipidi, una volta estratti e dispersi come monostrato, sarebbe il doppio della

superficie delle cellule da cui sono stati estratti.

prima cosa, misurarono l’area superficiale totale dei globuli rossi.

Per Successivamente estrassero i fosfolipidi dalla loro membrana e li posero su

una bacinella d’acqua, utilizzando una bilancia di Langmuir. Questa bilancia era formata da una

vaschetta con due barriere: una fissa collegata a un trasduttore di forza e una mobile che serviva a

comprimere i lipidi. Quando i fosfolipidi venivano messi sull’acqua, si orientavano con le teste polari

verso l’acqua e le code apolari verso l’aria, formando un monostrato.

Avvicinando lentamente la barriera mobile alla fissa, i ricercatori osservavano il punto in cui i fosfolipidi

cominciavano a comprimersi fino a toccarsi, generando una forza rilevata dal trasduttore: quello era il

momento in cui si era formato un monostrato compatto. A quel punto veniva calcolata l’area occupata

dal monostrato.

Il risultato fu sorprendente: l’area totale occupata dal monostrato di fosfolipidi era circa il doppio di

quella della superficie totale dei globuli rossi. Questo portò Gorter e Grendel a concludere che la

membrana cellulare è formata da un doppio strato fosfolipidico, con le code idrofobe rivolte verso

l’interno e le teste idrofile verso l’esterno.

L’esperimento, pur con alcuni limiti tecnici (come errori di misura o sottostima dei lipidi), rappresentò

la prima evidenza quantitativa a favore della struttura a doppio strato della membrana cellulare. 1

2. ESPERIMENTO BASATO SULLA CAPACITÀ ELETTRICA DELLA MEMBRANA STESSA

La membrana cellulare può essere assimilata a un condensatore elettrico, un

componente che accumula cariche elettriche separandole. Questa analogia è

possibile grazie alla struttura della membrana: le teste polari dei fosfolipidi,

rivolte verso l’esterno e l’interno della cellula, sono conduttrici, mentre le

code apolari, orientate verso l’interno del doppio strato, agiscono come

materiale dielettrico, cioè isolante.

In un condensatore, quando si applica una corrente, le cariche positive si

accumulano su un’armatura e non possono attraversare il materiale isolante. Tuttavia, la loro presenza

delle cariche sull’altra armatura. Anche nella

induce un campo elettrico che provoca la separazione

membrana cellulare, quindi, si genera una differenza di potenziale senza che le cariche attraversino

direttamente la membrana.

La capacità elettrica (C) di un condensatore (e quindi della membrana) si calcola con la formula:

=∙

dove:

 è la costante dielettrica del materiale (in questo caso dei lipidi),

 è la superficie della membrana (cioè delle armature),

 è lo spessore del doppio strato (la distanza tra le due armature).

1,

Conoscendo la capacità per unità di superficie (tipicamente ) e il valore della costante dielettrica

2

−13

= 5 ∙ 10

del materiale lipidico ( ), si può ricavare lo spessore della membrana:

−13

5 ∙ 10 −7

= = = 5 ∙ 10 = 50Å

−6

1 ∙ 10

Il valore ottenuto per lo spessore (50 Å) è coerente con le osservazioni sperimentali e conferma che la

membrana plasmatica è costituita da un doppio strato fosfolipidico.

Questo esperimento è quindi una prova quantitativa indiretta dell’esistenza e dello spessore del bilayer

lipidico nella membrana cellulare. 2

3. MOVIMENTO DELLE PROTEINE NEL DOPPIO STRATO LIPIDICO (cellula chimera)

Per dimostrare che le proteine di membrana sono in grado di muoversi

lateralmente all’interno del doppio strato fosfolipidico, è stato eseguito un

esperimento su una cellula chimera, ottenuta dalla fusione di una cellula umana

e una cellula di topo. Queste cellule esprimono proteine di membrana diverse,

che possono essere riconosciute e marcate da anticorpi specifici.

Nel mezzo di coltura vengono aggiunti anticorpi fluorescenti, ciascuno legato

a un fluoroforo diverso (molecole che, colpite da luce a una certa lunghezza

d’onda, emettono fluorescenza a una lunghezza d’onda maggiore). Ad

esempio:

 del topo → fluoroforo verde

Anticorpi anti-proteine

 umane → fluoroforo rosso

Anticorpi anti-proteine

Appena dopo la fusione, sulla superficie della nuova cellula si osserva una

distribuzione asimmetrica: da un lato le proteine del topo (fluorescenza verde),

dall’altro quelle umane (fluorescenza rossa). Tuttavia, dopo un certo tempo di

incubazione a 37°C, le due fluorescenze iniziano a mescolarsi sulla membrana, distribuendosi in modo

uniforme. Questo fenomeno è indicativo di un movimento laterale delle proteine lungo il piano della

membrana.

L'esperimento dimostra che le proteine non sono statiche, ma possono diffondere nella membrana, grazie

alla fluidità del doppio strato fosfolipidico. Tuttavia, non tutte le proteine si muovono: alcune sono

ancorate al citoscheletro o ad altre strutture intracellulari, e perciò risultano statiche anche dopo lungo

tempo.

Questo esperimento è una prova diretta della teoria del mosaico fluido proposta da Singer e Nicolson

nel 1972, secondo la quale la membrana è una struttura dinamica in cui i lipidi e molte proteine possono

muoversi lateralmente, permettendo funzionalità importanti come la comunicazione cellulare, la

migrazione e la formazione di sinapsi 3

“PHOTOBLEACHING”:

4. ESPERIMENTO MEDIANTE EFFETTO movimento delle proteine

Esperimento mediante effetto “photobleaching” (FRAP) –

L’esperimento di

Movimento delle proteine di membrana.

photobleaching (o FRAP: Fluorescence Recovery After

Photobleaching) è una tecnica utilizzata per studiare il

movimento laterale delle proteine nella membrana cellulare.

Le proteine di membrana vengono innanzitutto rese fluorescenti

legandole a molecole che emettono fluorescenza se illuminate

con una certa lunghezza d’onda. In condizioni iniziali, la

fluorescenza è uniformemente distribuita su tutta la membrana cellulare, e la sua intensità può essere

misurata.

Successivamente, una piccola regione della membrana viene colpita da una luce molto intensa per un

breve tempo. Questa luce forte spegne irreversibilmente la fluorescenza in quella zona: è il cosiddetto

effetto di sbiancamento ("bleaching"), in cui le molecole fluorescenti perdono la capacità di emettere

luce. Dopo questa fase, l’area sbiancata appare più scura rispetto al resto della membrana.

Nei minuti successivi si osserva un progressivo recupero della fluorescenza nella zona sbiancata. Questo

avviene perché le proteine mobili fluorescenti delle aree vicine si diffondono lateralmente nella regione

sbiancata, sostituendo quelle che avevano perso la fluorescenza.

della fluorescenza nel tempo, si può:

Monitorando il recupero dell’intensità

Determinare la frazione mobile: ad esempio, se la fluorescenza torna al 55% del valore iniziale, vuol

dire che il 55% delle proteine è mobile, mentre il 45% è immobile (legate al citoscheletro o ad altre

strutture).

Osservare l’andamento temporale: la curva di recupero cresce rapidamente all’inizio, poi tende a un

asintoto, indicando che il processo ha raggiunto un equilibrio.

Questo esperimento dimostra chiaramente che una porzione significativa delle proteine di membrana

può muoversi lateralmente, confermando la natura fluida e dinamica del doppio strato lipidico, come

descritto nel modello del mosaico fluido. 4

5. VELOCITÀ DI PERMEAZIONE

La permeazione di una sostanza all’interno della cellula dipende dalla

permeabilità della membrana alla sostanza stessa. Questo processo può

essere descritto con una legge esponenziale: 1

−

, = (1 − )

dove:

 , è la concentrazione intracellulare al tempo t,

 è la concentrazione extracellulare (costante),

 è la costante di tempo.

La costante di tempo è data da:

= ∙

dove:

 è il volume della cellula,

 è la superficie della membrana,

 è il coefficiente di permeabilità della sostanza x.

dell’esperimento ( = 0)

All’inizio la concentrazione intracellulare è zero. Col passare del tempo, la

sostanza entra nella cellula fino a raggiungere una concentrazione interna pari a quella esterna, cioè si

raggiunge l’equilibrio. A = , la concentrazione intracellulare ha raggiunto il 63% del valore finale.

Dal grafico che mostra le curve di ingresso per sostanze A, B, C, D, E, F, si nota che:

 ,

Le sostanze con curve più ripide (es. A) hanno una bassa quindi alta permeabilità.

 ,

Le sostanze con curve più lente (es. F) hanno una alta quindi bassa permeabilità.

Poiché è inversamente proporzionale a , un coefficiente di permeabilità maggiore significa tempo

di ingresso più breve e quindi una maggiore velocità di permeazione.

Inoltre, dipende anche dal rapporto tra volume e superficie (V/A) della cellula: cellule più piccole (con

V/A minore) avranno una minore e quindi una permeazione più veloce rispetto a cellule più grandi.

In conclusione, la velocità di permeazione di una sostanza dipende sia dalla sua permeabilità intrinseca

sia dalle dimensioni geometriche della cellula. L’analisi delle curve permette di ordinare le sostanze per

permeabilità e di comprendere le dinamiche di trasporto passivo attraverso la membrana. 5

6. EFFETTI OSMOTICI PERMANENTI E TRANSITORI

L’esperimento analizza come il volume cellulare cambi

nel tempo in risposta a soluzioni con soluti permeabili o

impermeabili, distinguendo tra effetti osmotici transitori

e permanenti. Viene utilizzata una fibra muscolare di

rana, inizialmente immersa in una soluzione fisiologica di

Ringer (isotonica), dove la cellula mantiene un volume

stabile al 100%.

Successivamente, la fibra viene trasferita in una soluzione

ipertonica (con osmolarità doppia rispetto a Ringer):

l’acqua fuoriesce per osmosi, causando una riduzione del

volume cellulare fino al 60%. Per verificare che la

variazione sia reversibile, la fibra viene nuovamente immersa in Ringer, dove recupera il volume

iniziale. A questo punto, la fibra viene immersa in soluzioni contenenti diversi soluti:

 permeabile alla membrana. Penetra nella cellula più rapidamente dell’acqua,

Etanolo: estremamente

impedendo una variazione di volume, poiché l’osmolarità si equilibra istantaneamente. Non si

osservano variazioni osmotiche.

 Xilosio: uno zucchero impermeabile. L’acqua esce dalla cellula per compensare l’eccesso

extracellulare, provocando una perdita permanente di volume. Poiché lo xilosio non entra,

l’equilibrio non si ristabilisce.

 Glicerolo (e analogamente urea): parzialmente permeabili. Inizialmente l’acqua esce più

velocemente, riducendo il volume cellulare. Tuttavia, col tempo il soluto entra nella cellula, seguito

dall’acqua, e il volume viene ripristinato. Si tratta quindi di variazioni transitorie.

Infine, tutte le cellule vengono reimmerse in Ringer e tutte, tranne quelle trattate con xilosio, recuperano

il volume iniziale, confermando la reversibilità delle variazioni osmotiche causate da soluti permeabili.

Conclusione:

 Soluti permeabili (come etanolo, glicerolo, urea): causano effetti osmotici transitori o nulli.

 Soluti impermeabili (come xilosio): provocano effetti osmotici permanenti.

L’esperimento dimostra che la permeabilità del soluto è il fattore determinante nella risposta osmotica

della cellula. 6

7. CINETICA DEL TRASPORTO MEDIATO

Il grafico illustra la cinetica del trasporto mediato, ossia il

meccanismo attraverso cui molecole come il glucosio

attraversano la membrana cellulare grazie a proteine

carrier. A differenza della diffusione passiva, che cresce

linearmente con la concentrazione e non richiede proteine

né energia, la diffusione facilitata mostra una cinetica di

saturazione, descritta dall’equazione di Michaelis-

Menten.

Secondo questa equazione, la velocità di trasporto (V)

dipende da due parametri:

 Vmax: la velocità massima di trasporto, raggiunta quando tutti i carrier sono saturi;

 Km: la concentrazione di glucosio alla quale la velocità è pari a metà di Vmax. Km rappresenta

quindi un indice di affinità: un valore basso di Km indica alta affinità del carrier per il substrato.

Nel grafico a sinistra, vediamo che inizialmente la velocità cresce rapidamente con la concentrazione di

glucosio, ma tende ad appiattirsi verso un plateau (Vmax), riflettendo la saturazione dei trasportatori.

La diffusione passiva, invece, non presenta saturazione ed è rappresentata da una retta.

A destra è riportato il doppio reciproco di Lineweaver-Burk, ottenuto graficando 1/V in funzione di

1/[S]. Questa rappresentazione lineare semplifica l’analisi:

 L’intercetta sull’asse y corrisponde a 1/Vmax;

 L’intercetta sull’asse x corrisponde a -1/Km;

 La pendenza della retta è pari a Km/Vmax.

Questo metodo consente di calcolare con precisione i parametri cinetici del trasporto. 7

8. TRASPORTI DEL GLUCOSIO Il trasporto del glucosio nelle cellule avviene tramite

diverse isoforme del trasportatore GLUT, ognuna con

caratteristiche specifiche e adattate alla funzione del

tessuto in cui si trovano. Il grafico descritto mostra

sull’asse X la concentrazione extracellulare del glucosio

(in mM) e sull’asse Y la velocità di ingresso del glucosio

nelle cellule.

Vengono messi a confronto GLUT 3, presente nelle cellule

β del pancreas.

nervose, e GLUT 2, presente nelle cellule

Le due isoforme differiscono principalmente per il valore

della Km, ovvero la concentrazione di glucosio alla quale

la velocità di trasporto è pari alla metà della velocità massima (Vmax).

 GLUT 3 ha una Km molto bassa, quindi trasporta glucosio in modo molto efficiente anche a basse

concentrazioni. Questo permette alle cellule nervose di mantenere una costante e massima

assunzione di glucosio, indipendentemente dalle fluttuazioni glicemiche. Dato che i neuroni

fortemente dal glucosio per l’energia, il loro trasporto deve essere sempre attivo e vicino

dipendono

alla Vmax.

 GLUT 2, al contrario, ha una Km elevata, perciò la sua velocità di trasporto aumenta gradualmente

all’aumentare della glicemia. Questo è fondamentale per la funzione delle cellule β pancreatiche,

che utilizzano il glucosio come segnale per la secrezione dell’insulina. Quando la glicemia è alta (es.

dopo i pasti), il maggiore ingresso di glucosio tramite GLUT 2 stimola la secrezione di insulina;

glicemia è bassa, il trasporto è ridotto e l’insulina non viene secreta.

quando la

striscia rossa nel grafico rappresenta la variazione fisiologica della glicemia nell’arco della giornata,

La

da circa 6 mM a 14 mM. GLUT 3 lavora sempre al massimo, mentre GLUT 2 risponde dinamicamente

ai cambiamenti glicemici, svolgendo un ruolo cruciale nella regolazione dell’omeostasi del glucosio.

8

+ +

9. GRAFICO CHE DIMOSTRA IL RAPPORTO [3:2] DELLA POMPA ELETTROGENICA Na /K

(Na⁺/K⁺ ATPasi) è un meccanismo attivo

La pompa sodio-potassio

fondamentale per mantenere l’equilibrio ionico delle cellule. Essa

scambia 3 ioni Na⁺ verso l’esterno con 2 ioni K⁺ verso l’interno,

generando così un bilancio elettrico positivo verso l’esterno. Questo

rende la pompa elettrogenica, in quanto contribuisce direttamente alla

polarizzazione della membrana.

L’esperimento è stato condotto su globuli rossi umani, sfruttando la

sensibilità della pompa alla temperatura. Le cellule sono inizialmente

incubate per 9 giorni a 2°C in una soluzione fisiologica con alto sodio e

basso potassio. A questa temperatura la pompa è inattiva e si raggiunge

un equilibrio passivo: il sodio entra e il potassio esce, portando a un

con l’ambiente esterno.

livellamento delle concentrazioni intracellulari

Nel secondo stadio, le cellule vengono portate a 37°C, temperatura

fisiologica alla quale la pompa si riattiva. Tuttavia, se nella soluzione non è presente potassio, la pompa

non funziona, poiché entrambi gli ioni sono necessari per il meccanismo di scambio.

Dopo due ore, viene aggiunto potassio (es. tramite KCl), e si osserva che la pompa inizia a funzionare:

il sodio intracellulare diminuisce e il potassio intracellulare aumenta. La variazione nel tempo delle due

concentrazioni viene tracciata nel grafico (asse X: tempo a 37°C; asse Y: concentrazione intracellulare

di Na⁺ e K⁺).

La pendenza delle curve indica che la velocità di uscita del sodio è 1,5 volte maggiore rispetto alla

velocità di ingresso del potassio, confermando il rapporto 3:2. Questo rapporto è stato a lungo dibattuto

e l’esperimento lo dimostra chiaramente, anche grazie al fatto che il cambiamento ionico dipende dalla