Fondamenti neurobiologici e genetici

Prima lezione (29 sett) fondamenti di neuro e genetica

• Slide introduttive su Blackboard (salvate su OneDrive)
• No libro

Seconda legge della legge fondamentale = termodinamica (il nostro universo è tropico, passiamo da organizzazione a disorganizzazione spontaneamente senza l'intervento di energia) = legge per cui l'universo tende al disordine.

Gli organismi viventi usano l'energia chimica, ma che prende origine dall'energia solare. Ci sono autotrofi ed eterotrofi (sfruttano l'energia chimica degli autotrofi). Viene sfruttata l'energia dei legami chimici.

Gli organismi viventi sono caratterizzati dal fatto che sono in grado di mantenere la propria organizzazione. Quando si diventa anziani si perde un po' di organizzazione, si perde quando si muore.

Gli organismi viventi si riproducono = mantengono l'organizzazione nel tempo perché sono in grado di riprodursi. Questo perché utilizzano l'energia che deve essere costante sempre.

Autotrofi ed eterotrofi: differenze e cose in comune

• Tutti gli esseri viventi usano nel loro metabolismo l'energia chimica.
• Autotrofi = capaci di immagazzinare l'energia del sole creando un composto organico. Il guscio di valenza più esterno della clorofilla si amplia e cattura l'energia solare. Questa energia viene rilasciata per costruire una molecola organica = sfruttano l'energia del sole per sintetizzare il glucosio.
• Eterotrofi = ci procuriamo elementi nutritivi, li assorbiamo e scomponiamo attraverso la dieta. Usiamo questi elementi a seconda della loro natura chimica per produrre energia.

Le macromolecole

Le macromolecole (introduzioni di alimenti nel corpo):

• Soddisfano l'esigenza energetica che ha l'organismo (pensare) (ruolo energetico).
• Rifornimento dei materiali per la crescita ed il rinnovamento delle strutture dell'organismo (ruolo strutturale).
• Necessità di elementi nutrizionali (H₂O, vitamine (non vengono degradate ma aiutano le proteine e gli enzimi a far avvenire le reazioni metaboliche) e sali minerali) che non hanno funzione energetica, ma sono essenziali (ruolo funzionale = far avvenire efficientemente il metabolismo). Servono a far avvenire il metabolismo cellulare = insieme di reazioni biochimiche che fanno funzionare le nostre cellule (anabolismo (produco energia) e catabolismo (uso energia e distruggo le macromolecole facendole diventare più semplici)).

Per l'uomo esiste una quarta dimensione legata all'alimentazione = componente cognitiva. Importante sempre l'aspetto psicologico legato alla nutrizione (mangiare una torta insieme può renderci felici, i cibi afrodisiaci). Ci sono tanti aspetti positivi che noi associamo all'alimentazione ma alcune volte non è così e non va mai dimenticato.

Seconda lezione 30 sett

Una persona, quando fa ricerca scientifica, si pone degli obiettivi e cerca di trovare sperimentalmente una soluzione ai problemi che si è posto. Come detto ieri, esistono diverse aree del sapere umano, e non tutte procedono utilizzando il metodo scientifico: ci sono tanti altri approcci. Tuttavia, alcune discipline — come la matematica, la fisica, la chimica, la biologia e la medicina — fanno ampio uso del metodo scientifico per ottenere risultati affidabili.

Anche alcune parti delle scienze umane, come certe branche della psicologia o della sociologia, utilizzano il metodo scientifico per ottenere conoscenze. Altre aree della psicologia, invece, non lo utilizzano, ma arrivano comunque a determinati tipi di risultati. Insomma, tutto dipende dall’ambito che si sta considerando. In base all’ambito, può essere utile usare il metodo scientifico oppure altri metodi.

Perché allora il metodo scientifico è così importante? Perché tutte le conoscenze fondamentali relative alla biologia, alla genetica e al funzionamento dei neuroni sono state ottenute utilizzando proprio questo metodo.

La scienza è una forma del sapere umano (conoscenza) caratterizzata da un metodo che ha 2 requisiti fondamentali:

• Rigore
• Oggettività

La scienza ha un movente.

Il metodo scientifico

Importante perché le conoscenze sono state tutte ottenute usando questo metodo.

6 fasi:

1. Osservazione di un fenomeno naturale.
2. Porsi il problema (perché lo osservo...).
3. Ipotesi di soluzione.
4. Verifica (sperimentale, usando strumenti o composti) o confutazione.
5. Conclusione o teoria.
6. Comunicazione.

Osservazione

Osservazione attenta, curiosa, senza pregiudizi e possibilmente ripetuta del fenomeno.

Si osserva un fenomeno con attenzione e curiosità, senza pregiudizi, possibilmente in più momenti e condizioni. Ad esempio: perché osservo un certo fenomeno di giorno e non di notte?

Definizione corretta del problema

Significa: una domanda giusta posta nel modo giusto. Esempio: come mai avviene il fenomeno “X” nelle condizioni “Y” e non avviene nelle condizioni “Z”? Qual è la causa di ciò che ho osservato? Che relazione esiste tra lo stimolo “X” e la risposta “Y”?

Ci si interroga sulle cause del fenomeno osservato. Perché avviene? Da cosa dipende? Si cerca di formulare la domanda giusta. Per esempio: “Come mai si osserva questo cambiamento nel campo visivo di certi pazienti di sera e non di giorno?”

Formulazione di una o più ipotesi di soluzione del problema

Tentativo logico e valutabile di risposta alla domanda. Possono essere formulate diverse ipotesi scientifiche da parte di un singolo ricercatore o di più studiosi che lavorano indipendentemente; esse vengono normalmente aggiornate, modificate o scartate sulla base della loro evidenza o inevidenza e dei dati osservazionali o sperimentali acquisiti.

Si avanza un’ipotesi logica che possa spiegare il fenomeno. Ad esempio: “Forse le cellule dei bastoncelli nei pazienti con quella patologia sono alterate e quindi reagiscono diversamente alla luce serale.” L’ipotesi nasce come “spina nel fianco”: dopo essersi posti il problema, lo scienziato si chiede perché e formula un’ipotesi da verificare.

Verifiche delle ipotesi

Le verifiche o la confutazione possono essere di tipo osservazionale o sperimentale.

Si progettano esperimenti per verificare la bontà o meno dell’ipotesi. Per esempio, si possono usare strumenti per osservare il funzionamento dei bastoncelli e dei coni in condizioni di luce differenti. A volte, le verifiche sperimentali dimostrano che l’ipotesi era corretta; altre volte, mostrano che era completamente sbagliata.

Conclusione o proposta di una teoria scientifica

La teoria scientifica è una ipotesi avente valore predittivo, suffragata da numerose e convincenti verifiche, e non (ancora) confutata da alcuna osservazione contraria alla previsione.

Le teorie scientifiche non sono assolute (esenti da ulteriori verifiche o confutazioni) né immutabili, ma possono essere riviste, corrette, integrate (esempio: Dogma centrale della biologia).

Se i risultati sperimentali confermano l’ipotesi, si scrive in modo chiaro e dettagliato ciò che si è ottenuto. Un tempo si parlava di “formulare una teoria”, come nel caso del dogma centrale della biologia. Oggi si pubblicano i risultati in contesti scientifici, descrivendo con precisione ogni passaggio: l’osservazione, il problema, l’ipotesi, la verifica e i risultati ottenuti.

Comunicazione alla comunità scientifica

Il carattere “pubblico” della scienza e la sua “oggettività” richiedono la comunicazione (orale o scritta: pubblicazione) dei dati, delle ipotesi, delle verifiche e della eventuale teoria proposta.

Questa fase è importante quanto le altre. I risultati vengono presentati a congressi nazionali e internazionali, dove ci sono altri scienziati che studiano gli stessi fenomeni. Per esempio, nei congressi della Padolla Academy of Neurology partecipano migliaia di neurologi, genetisti e biotecnologi. In questi incontri, i ricercatori condividono risultati importanti, ad esempio su patologie neurologiche rare, per permettere alla comunità scientifica di progredire collettivamente.

La comunicazione nella comunità scientifica

Quando un ricercatore presenta i suoi risultati, dopo la presentazione si apre sempre una discussione. Altri professionisti possono fare domande di approfondimento o criticare aspetti tecnici. Per esempio, qualcuno può chiedere: “Perché hai usato quella tecnica per misurare la produzione di ATP nei neoblasti? Secondo me lo strumento non è adatto, dovresti usarne uno più sofisticato.”

Alcune domande servono a capire meglio; altre sono veri confronti critici, anche accesi.

In alcuni casi, le discussioni portano informazioni preziose e suggerimenti utili. In altri, i colleghi “ti cavano la pelle di dosso”: capita soprattutto quando i risultati sono nuovi o controversi. Un episodio emblematico: dieci anni fa, all’Università di Tokyo, durante una mia presentazione, un gruppo cinese iniziò con domande e finì in un confronto molto duro, durato venti minuti, sotto gli occhi di un chairman giapponese. Non si trovava un accordo, e la discussione è proseguita anche durante la pausa caffè.

Questi confronti, per quanto impegnativi, sono fondamentali. Se un risultato è scientificamente valido, deve poter essere discusso, replicato e compreso da altri esperti del settore. In questo modo, i dati possono essere utilizzati da altri ricercatori per proseguire gli studi, ampliando la conoscenza collettiva.

La comunicazione può avvenire in due modi:

• Presentazioni a convegni: servono per avere un primo riscontro dalla comunità scientifica e raccogliere critiche e suggerimenti.
• Pubblicazioni scientifiche: i risultati vengono scritti in modo rigoroso e inviati a riviste scientifiche per la revisione tra pari.

Il processo di pubblicazione

Quando uno scienziato scrive un articolo, deve indicare cosa ha fatto, per quanto tempo, quali dosi ha usato, cosa ha osservato e quali risultati ha ottenuto.

L’articolo viene inviato a una rivista scientifica, che lo sottopone a peer review cieca: i revisori non conoscono l’identità degli autori e viceversa. Vengono scelti esperti del settore per valutare la validità dello studio.

Se tutti i revisori danno parere positivo, l’articolo viene pubblicato e diventa di dominio pubblico. Se, per esempio, due revisori sono positivi e uno negativo, l’editore può chiedere agli autori di rispondere alle critiche prima di prendere una decisione.

Un revisore negativo deve spiegare perché: può criticare l’uso di tecniche obsolete, un campione troppo piccolo, l’uso di test statistici inappropriati (parametrici invece di non parametrici), ecc. Gli autori devono rispondere punto per punto e, se necessario, rivedere il lavoro.

Importanza dell'etica scientifica

Purtroppo, non tutti rispettano il metodo scientifico. Alcuni pubblicano libri senza alcuna base scientifica. Un caso di 15 anni fa: un professore dichiarava di curare i tumori con infusioni costose (20.000 euro), ma non aveva mai pubblicato un articolo scientifico, solo libri. In realtà non somministrava cellule staminali né seguiva protocolli validi. Questo è eticamente gravissimo: illudeva i pazienti, traendone profitto.

La comunità scientifica esiste proprio per evitare simili truffe. Un risultato valido deve essere oggettivo, replicabile e condiviso attraverso canali scientifici. Se non lo è, viene rapidamente smascherato nei congressi e nelle revisioni.

Sintesi finale

Esempio di ricerca scientifica (vedo slide e ascolto 25 min).

Studio sulla natura chimica della sostanza che induce una trasformazione ereditabile in un tipo di pneumococchi (Oswald T. Avery, Colin M. MacLeod e MacLyn McCarty - The Rockefeller Institute for Medical Research New York (USA)).

L'esperimento storico di Griffith

Il DNA fu identificato come materiale ereditario per la prima volta grazie agli esperimenti di Frederick Griffith e, successivamente, approfondito da tre giovani ricercatori (Avery, MacLeod e McCarty). Griffith condusse i suoi esperimenti negli Stati Uniti, presso un’istituzione di New York. Partì dalle osservazioni contenute in un articolo appena pubblicato da un altro professore e utilizzò come modello batteri del genere Streptococcus pneumoniae, chiamati anche pneumococchi.

Egli osservò che esistevano due ceppi di questi batteri:

• Ceppo R1. (Rough) “R” sta per rugoso. Questi batteri non possiedono capsula, quindi, quando vengono fatti crescere su una piastra di agar, formano colonie con contorni irregolari e rugosi.
• Ceppo S2. (Smooth) “S” sta per liscio. Questi batteri sono capsulati, e quando crescono su agar formano colonie lisce, lucide, simili a cera sciolta sul tavolo.

L’agar è un terreno nutriente utilizzato per far crescere batteri. Ogni colonia contiene circa 500–1000 batteri derivati da un singolo individuo.

Griffith notò che i ceppi R erano innocui: se inoculati nei topi, questi rimanevano sani. Al contrario, i ceppi S erano patogeni: se inoculati, i topi sviluppavano polmonite e morivano. Dunque, la differenza tra R e S era legata a un principio di patogenicità, che sembrava risiedere nella capsula.

Il principio trasformante

Per capire la natura di questo principio, Griffith fece un esperimento cruciale: prese un ceppo S, lo uccise mediante calore (bollitura a circa 80–100 °C), e inoculò il materiale in 10 topolini. Questi topi non si ammalarono, confermando che i batteri morti non erano più virulenti.

Poi fece qualcosa di sorprendente: prese batteri R vivi (non patogeni) e li mescolò con batteri S uccisi dal calore. Inoculò questa miscela in altri 10 topi… e tutti morirono.

Non solo: dai tessuti dei topi morti riuscì a isolare ceppi S vivi e patogeni. Questo significava che qualcosa era passato dai batteri S morti ai batteri R vivi, trasformandoli in ceppi S virulenti.

Griffith concluse che esisteva un “principio trasformante” in grado di trasferire l’informazione genetica della virulenza da un batterio all’altro, anche se il donatore era morto.

Inoltre, dimostrò che questa trasformazione era ereditabile: se i batteri trasformati venivano coltivati di nuovo, continuavano a produrre colonie lisce e patogene in modo stabile nel tempo.

Disegno sperimentale dello studio

Altri 3 ragazzi vogliono capire cosa è questo principio trasformante e hanno creato nuovi esperimenti. Si chiedono cosa induce la trasformazione.

Osservazione — In vivo, l’inoculazione simultanea di pneumococchi tipo R (non patogeni) vivi e di pneumococchi tipo S (patogeni) uccisi al calore provoca la morte del topo per infezione batterica. In vitro, estratti cellulari grezzi (che contengono diverse sostanze chimiche presenti nelle cellule batteriche) di pneumococchi tipo S, se aggiunti a colture di tipo R, provocano una trasformazione da tipo R a tipo S, permanente ed ereditaria.

Definizione del problema — Che cosa induce la trasformazione da batteri di tipo R, non capsulati e non patogeni, a batteri di tipo S, capsulati e patogeni? Qual è il “principio attivo, trasformante” o la sostanza inducente di questa mutazione ereditaria? A quale classe di composti chimici appartiene?

Ipotesi —

1. Un acido desossiribonucleico (DNA)?
2. Un acido ribonucleico (RNA)?
3. Una proteina?
4. Un polisaccaride?

Verifica sperimentale — Una sostanza chimicamente identificabile nel sale di sodio del DNA molecolarmente integro, estratta da pneumococchi tipo S e purificata da lipidi, polisaccaridi, proteine e RNA, se aggiunta in vitro a ceppi tipo R, induce la loro trasformazione in batteri tipo S patogeni. Ciò non avviene se il DNA viene trattato con enzimi idrolitici (desossiribonucleasi), che depolimerizzano (degradano) la molecola scindendola nelle sue unità monomeriche (distruzione enzimatica del DNA).

Conclusione —

1. La molecola del DNA integra nella sua struttura, “è l’unità fondamentale del principio trasformante” degli pneumococchi tipo R (non capsulati e non patogeni) in pneumococchi tipo S (capsulati e patogeni).
2. La trasformazione è permanente ed ereditaria.

Comunicazione scritta — Journal of Experimental Medicine, 1943;79:137-158.

Riassunto = l'informazione che può trasformare un ceppo non virulento in uno virulento è contenuta nel DNA. Il frammento di DNA che conteneva le informazioni per la produzione della capsula polisaccaridica.

Esperimento di Avery, MacLeod e McCarty

A partire dagli esperimenti di Griffith 3 ricercatori — Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty — decisero di capire quale fosse la natura chimica del principio trasformante. Essi misero a punto protocolli per isolare selettivamente le diverse componenti delle cellule batteriche: DNA, RNA e proteine.

1. Estrazione del materiale genetico Utilizzarono kit e tecniche di laboratorio per separare le macromolecole: solo DNA in forma pura, solo RNA, solo proteine, o polisaccaridi. Il loro primo obiettivo era verificare se il DNA fosse il principio trasformante.
2. Purificazione del DNA Prelevarono il materiale da ceppi S virulenti, lo purificarono in modo da ottenere solo frammenti di DNA, e lo aggiunsero a colture di ceppi R non virulenti.
3. Risultati Dopo una notte di incubazione, notarono che i ceppi R si erano trasformati in ceppi S virulenti. Questo dimostrava che frammenti di DNA erano entrati nelle cellule R, trasformandone il genoma e rendendole capaci di produrre la esperimento di Avery, MacLeod e McCarthy (1943) capsula.
4. Controllo con DNAsi Aggiunsero enzimi deossiribonucleasi (DNAsi), che tagliano e degradano il DNA. In queste condizioni, la trasformazione non avvenne più.
5. Controlli con RNAsi e proteasi Fecero esperimenti analoghi degradando RNA o proteine: la trasformazione avvenne comunque, segno che né l’RNA né le proteine erano responsabili.

Conclusione: solo il DNA era in grado di