Fisiologia veterinaria 1

Facoltà di medicina veterinaria Istologia a.s. 2025/26 – II semestre

L’esame istologico

L’analisi morfologica studia l’organizzazione strutturale delle cellule, delle varie parti di esse e dei costituenti extracellulari. L’analisi biochimica e funzionale ha lo scopo di studiare la natura chimica e le modalità di funzionamento delle cellule, delle loro parti e dei tessuti. I due principali procedimenti di analisi morfologica sono:

• L’osservazione a fresco delle cellule
• L’osservazione di cellule e di tessuti uccisi con procedimenti che ne conservano l’organizzazione strutturale il più possibile simile a quella delle cellule e dei tessuti viventi, cioè dopo fissazione

L’esame istologico (o istopatologico) è l'analisi al microscopio di un campione di tessuto prelevato da un organo, fondamentale per diagnosticare con precisione malattie come tumori (benigni o maligni), infiammazioni o infezioni. Attraverso tecniche di fissazione, inclusione e colorazione, il patologo studia le cellule per identificare la natura della lesione e guidare il trattamento.

I passaggi dell’esame istologico

I passaggi sono molto importanti da trattare coi tempi giusti

1. Prelievo
2. Fissazione

La fissazione è il primo passaggio fondamentale dell’esame istologico. Serve a bloccare rapidamente i processi di degradazione che iniziano appena il tessuto viene prelevato (autolisi enzimatica e decomposizione batterica) e a preservare il più possibile la struttura cellulare e tissutale così com’era in vivo. La fissazione, quindi, serve a stabilizzare proteine, membrane e organelli rendendo il campione manipolabile durante i passaggi successivi. Essa inoltre consente ai coloranti di penetrare nelle cellule e di fissarsi a particolari strutture cellulari mettendole meglio in evidenza.

Il fissativo provoca:

• Denaturazione o reticolazione delle proteine, che “immobilizza” le strutture cellulari
• Inattivazione degli enzimi, quindi stop all’autolisi
• Aumento della consistenza del tessuto, utile per il taglio al microtomo
• Conservazione dei rapporti morfologici tra cellule e matrice

La fissazione può essere fisica o chimica. La fissazione fisica si opera per congelamento rapido. La fissazione chimica invece utilizza sostanze chimiche in grado di far precipitare le proteine come l’alcol etilico. Oppure si utilizzano sostanze che non precipitano le proteine tra cui il fissante più comune è la formalina tamponata al 10%, che deriva dalla formaldeide. È molto usata perché penetra bene, conserva discretamente la morfologia e funziona per la maggior parte delle colorazioni routine (come ematossilina-eosina).

Una fissazione sbagliata compromette tutto l’esame, perché gli artefatti prodotti non sono più correggibili nei passaggi successivi.

3. Lavaggio

Il lavaggio serve a rimuovere l’eccesso di fissativo dal tessuto. Questo è importante perché residui di fissativo possono:

• Interferire con le colorazioni
• Creare precipitati o artefatti
• Continuare a indurire il tessuto più del necessario

Di solito si usa acqua corrente o tamponi. Il tempo dipende dal fissativo: con formalina spesso bastano minuti–alcune ore, mentre fissativi più aggressivi richiedono lavaggi più accurati. Il lavaggio “stabilizza” il campione e lo porta a una condizione neutra prima dei passaggi successivi.

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4. Disidratazione

Nella disidratazione si rimuove progressivamente l’acqua dal tessuto. È un passaggio indispensabile perché la paraffina non miscela con l’acqua. La disidratazione avviene tramite passaggi in alcoli a concentrazione crescente, tipicamente: 40%, 70%, 80–95%, 100% (assoluto). La gradualità è fondamentale: se passi bruscamente ad alcol concentrato, il tessuto può restringersi, deformarsi o indurirsi troppo.

Durante la disidratazione l’acqua viene sostituita dall’alcol, il tessuto diventa più compatto e si prepara al passaggio successivo (diafanizzazione/chiarificazione con xilene o sostituti). La disidratazione serve a rendere possibile la sostituzione dei liquidi interni fino alla paraffina.

5. Chiarificazione

Lo scopo della chiarificazione è molto semplice ma cruciale: sostituire l’alcol con una sostanza miscibile sia con l’alcol sia con la paraffina. Poiché ora il tessuto è impregnato di alcol che però non è miscibile con la paraffina serve un liquido ponte. Durante la chiarificazione, il tessuto viene immerso in solventi organici (il più classico è lo xilene, o tuolo o benzolo). Questi solventi rimuovono l’alcol dal tessuto, rendono il tessuto trasparente (da qui il nome chiarificazione) e preparano il campione all’infiltrazione della paraffina.

6. Inclusione

L’inclusione è il passaggio in cui il tessuto viene impregnato e inglobato in un mezzo solido, quasi sempre paraffina, per permettere il taglio di sezioni sottilissime al microtomo. Dopo la chiarificazione il tessuto è pieno di solvente organico (es. xilene). A questo punto avviene prima l’infiltrazione con paraffina fusa e poi la vera inclusione.

L’inclusione quindi viene attuata allo scopo di conferire al campione biologico in esame la consistenza necessaria per sottoporlo alla fase di taglio.

L’inclusione viene effettuata in stufa a 50°-60°, a tale temperatura il solvente schiarente evapora e al suo posto entra la paraffina liquida. In seguito la paraffina viene fatta solidificare a temperatura ambiente entro appositi stampi contenenti il materiale biologico.

7. Taglio

Il blocchetto di materiale organico si taglia nel microtomo per poi essere raccolto nel vetrino porta campione, con una sezione massima di 7 micrometri. Il piano di taglio si sceglie in base a ciò che si vuole vedere.

8. Reidratazione

Dopo il taglio e la distensione della sezione, il preparato è passato in xilene e alcoli per togliere la paraffina. Prima di colorare bisogna riportarlo in ambiente acquoso, perché la maggior parte delle colorazioni è idrosolubile. La reidratazione avviene tramite passaggi in alcoli a concentrazione decrescente (100% → 95% → 80% → 70%) fino all’acqua.

Serve a rendere il tessuto permeabile ai coloranti, ripristinare uno stato simile a quello fisiologico ed evitare shock osmotici e distorsioni. Se la reidratazione è incompleta, la colorazione risulta irregolare o debole.

9. Colorazione

In istologia si definisce colorante qualsiasi sostanza che colora un campione legandosi stabilmente ad alcune sue strutture che rimangono colorate anche dopo ripetuti lavaggi. Le colorazioni possono essere:

• VitalI, che si attuano per mezzo di sostanze che possono essere iniettate direttamente nell’organismo;
• Non vitali, che possono essere coloranti acidi e coloranti basici (se la molecola è basica si usano coloranti acidi e viceversa). Tutti i tessuti che si colorano con coloranti basici vengono definiti basofili, perché assumono il colorante basico; tutti quei tessuti che assumono coloranti acidi vengono detti acidofili. Un esempio di colorante basico è l'ematossilina, usata per colorare il nucleo (che contiene gli acidi nucleici), mentre l’eosina è un colorante acido e va a colorare il citoplasma.

Le colorazioni servono a creare contrasto sfruttando interazioni chimiche tra coloranti e componenti cellulari. Le colorazioni vengono scelte in base all’affinità chimica. Coloranti acidofili e basofili non descrivono il pH del tessuto, ma l’affinità chimica delle strutture per coloranti acidi o basici.

Coloranti basici e strutture basofile

Un colorante basico ha carica positiva. Di conseguenza si lega a strutture cellulari cariche negativamente (acide). Le strutture basofile sono quindi ricche di:

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• DNA
• RNA
• Gruppi fosfato
• Ribosomi e reticolo endoplasmatico rugoso

Il classico esempio è l’ematossilina, che colora:

• Nucleo
• Nucleolo
• Regioni ricche di RNA

Il risultato è una colorazione blu-violacea.

Coloranti acidi e strutture acidofile (eosinofile)

Un colorante acido ha carica negativa e si lega a strutture cariche positivamente, soprattutto proteine citoplasmatiche. Le strutture acidofile sono ricche di:

• Proteine del citoplasma
• Filamenti del citoscheletro
• Mitocondri (per componente proteica)
• Fibre collagene

L’esempio tipico è l’eosina, che dà una colorazione rosa-rossastra.

Colorazione ematossilina-eosina durante l’allestimento del vetrino

Dopo la reidratazione, il vetrino viene immerso prima in ematossilina:

• Colora i nuclei
• Poi si fa lavaggio e “bluizzazione” per stabilizzare il colore

Successivamente si applica l’eosina:

• Controcolora citoplasma e matrice extracellulare
• Crea il contrasto fondamentale per leggere il tessuto

I coloranti possono inoltre essere semplici o combinati, i primi vengono usati singolarmente, mentre i secondi si ottengono appunto dalla combinazione di più coloranti. Le colorazioni che vengono maggiormente utilizzate sono:

• Ematossilina-Eosina (Nucleo – Citoplasma): la prima, essendo basica, colora la parte acida del nucleo sui toni del violetto; la seconda essendo acida, colora il citoplasma di arancione.
• Tricromica Azan-Mallory (T. Connettivo): utilizza Azocarminio (rosso intenso), acido fosfotungstico (mordenzante), blu di anilina (blu), viene utilizzata per colorare i tessuti connettivi.
• Orceina o Resorcina – fucsina (fibre elastiche): viene utilizzata per le fibre elastiche, come ad esempio le arterie
• Impregnazione argentica (Fibre reticolari): viene utilizzata per le fibre reticolari, ovvero quelle maglie presenti nelle cellule del fegato che vengono colorate di nero.
• Sudan (Tessuto Adiposo): vengono utilizzati per il tessuto adiposo. Si tratta di colorazioni specifiche che evitano lo scioglimento del grasso e quindi lo svuotamento della cellula.
• Tecnica di Cajal: utilizzata per la colorazione del sistema nervoso centrale, quindi dei neuroni.

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• Reazione di Fuelgen (DNA)
• PAS (carboidrati, glicoproteine)
• Giemsa (sangue)

Molto spesso, durante l’osservazione dei vetrini, si osserva la presenza di buchi lungo la superficie del tessuto; questi buchi non sono altro che tessuto adiposo. Con le colorazioni infatti, come ad esempio con l’Ematossilina-eosina, per procedere bisogna nuovamente disidratare il campione attraverso gli alcoli, che sciolgono il grasso presente nel tessuto.

10. Disidratazione

Dopo la colorazione il vetrino è di nuovo in acqua, ma per montarlo con mezzi resinosi bisogna eliminare l’acqua. Si ripete quindi una disidratazione con alcoli a concentrazione crescente fino all’alcol assoluto, seguita da chiarificazione in xilene. Serve a stabilizzare la colorazione e a preparare il vetrino al montaggio definitivo.

11. Montaggio

Consiste nell’applicare un mezzo di montaggio (resina sintetica o balsamo) e coprire la sezione con il coprioggetto. Serve per proteggere la sezione, preservare la colorazione nel tempo, migliorare la trasparenza ottica e mantenere il preparato osservabile per anni.

12. Osservazione del preparato

L’osservazione avviene in modo progressivo:

• Piccolo ingrandimento 4X → orientamento generale del tessuto
• Medio ingrandimento 10X → organizzazione e rapporti strutturali
• Grande ingrandimento 40X → dettagli cellulari e nucleari

Volendo si può utilizzare l’ingrandimento 100X che però è un obiettivo a immersione quindi si deve utilizzare un olio.

I microscopi che si possono utilizzare oltre a quello ottico sono quello elettronico TEM E SEM.

TEM – Transmission Electron Microscope (Microscopio elettronico a trasmissione)

Un fascio di elettroni passa attraverso un campione ultra-sottile (di solito 50–100 nm). Il campione deve essere preparato con fissazione, disidratazione, inclusione in resina e taglio ultrafine, spesso con colorazioni a metalli pesanti come osmio o uranio, che aumentano il contrasto. Dove gli elettroni passano liberamente il tessuto appare chiaro, dove sono assorbiti o diffusi il tessuto appare scuro. La risoluzione: molto alta, quindi permette di vedere organelli, membrane, virus, filamenti proteici.

SEM – Microscopio elettronico a scansione

Un fascio di elettroni scansiona la superficie del campione. Gli elettroni rimbalzano o inducono emissione di elettroni secondari, che vengono raccolti per creare l’immagine. Risoluzione minore rispetto al TEM, ma con una profondità di campo molto alta, quindi si vedono bene le strutture tridimensionali. Il campione è fissato, disidratato e ricoperto con uno strato conduttivo (oro o platino).

La citochimica e l’istochimica sono tecniche che vanno oltre la semplice morfologia. Non servono solo a vedere le cellule, ma a identificare la composizione chimica e la distribuzione di specifiche molecole nei tessuti. La differenza principale sta nel livello a cui lavori.

La citochimica studia la composizione chimica delle singole cellule e delle loro componenti. L’obiettivo è localizzare sostanze specifiche all’interno della cellula, come:

• Enzimi
• Lipidi
• Glicogeno
• DNA e RNA
• Proteine particolari

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Si applica spesso su cellule isolate, strisci citologici o colture cellulari. Un esempio classico è la dimostrazione dell’attività enzimatica in determinati organelli o la ricerca del glicogeno in epatociti.

L’istochimica, invece, studia la distribuzione delle sostanze chimiche all’interno dei tessuti mantenendo l’architettura tissutale. Non guardi solo la cellula, ma come le molecole sono organizzate nello spazio del tessuto e nei rapporti tra cellule e matrice extracellulare.

Serve per evidenziare:

• Mucopolisaccaridi
• Fibre collagene ed elastiche
• Lipidi
• Enzimi tissutali
• Glicoproteine

L’immunoistochimica è una tecnica che permette di identificare proteine specifiche nei tessuti usando anticorpi. È molto più selettiva rispetto alla citochimica e all’istochimica, perché sfrutta il riconoscimento altamente specifico anticorpo–antigene.

Nel contesto istologico, questo significa collegare morfologia e identità molecolare delle cellule, cosa fondamentale soprattutto in anatomia patologica. Il tessuto viene prima preparato come un normale vetrino istologico (fissazione, inclusione, taglio). Poi:

• Si applica un anticorpo primario che riconosce la proteina bersaglio
• Si aggiunge un anticorpo secondario marcato (con enzima o fluorocromo) che si lega al primario
• Il marcatore produce una reazione colorata o fluorescente visibile al microscopio

L’immunoistochimica serve a identificare tipi cellulari specifici, diagnosticare tumori e determinarne l’origine, valutare proliferazione cellulare, studiare recettori e marcatori prognostici.

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La materia

Composizione chimica del protoplasma

Il protoplasma è la materia vivente, cioè la sostanza fondamentale che costituisce le cellule di tutti gli organismi, ed è costituito da composti organici e inorganici:

• I composti organici sono rappresentati dai carboidrati o glucidi (1%), dai lipidi (2-3%), dalle proteine (10-20&) e dagli acidi nucleici (1-1,5%);
• I composti inorganici comprendono l’acqua (75-85%) e sali minerali (1%), C (carbonio), O (ossigeno), H (idrogeno), N (azoto), S (zolfo), P (fosforo);

Composti inorganici

L’acqua

Tra i composti inorganici l’acqua è sicuramente uno dei più importanti. Le cellule degli organismi superiori sono in gran parte costituiti di acqua e possono vivere soltanto se si trovano in ambienti acquosi. Questi organismi, quindi tendono ad evitare l’eccessiva perdita di acqua per mantenere intatto l’ambiente acquoso garantendo quindi delle condizioni ottimali per lo svolgimento delle funzioni cellulari. L’acqua inoltre ha un elevato calore specifico, per cui contribuisce al mantenimento della temperatura corporea degli organismi, evitando quindi variazioni notevoli della temperatura che causerebbero danni cellulari. L’acqua inoltre è anche il mezzo di trasporto delle sostanze nutritizie e degli e il mezzo per l’eliminazione di prodotti di rifiuto. In ambito cellulare, le molecole d’acqua possono essere suddivise in 2 tipi:

• L’acqua d’idratazione, che rappresenta circa il 40% dell’intero patrimonio idrico cellulare, è necessaria al funzionamento dei principali componenti molecolari della cellula.
• L’acqua di riempimento sostiene tutti quei fenomeni indispensabili per il ciclo cellulare, come l’equilibrio osmotico, la diffusione ecc.

Sali minerali

Presenti nei liquidi cellulari servono a mantenere la permeabilità di membrana, a regolare il gradiente, e a garantire il potenziale elettrico di membrana; Na, K e Cl sono tra i più presenti. Mentre K si trova prevalentemente all’interno della cellula, Na e Cl sono concentrati nei liquidi extracellulari e costituiscono il sistema principale per la regolazione della permeabilità di membrana. Un’eccezione è l’endolinfa che presenta uguali concentrazioni di Na e K uguale a quella endocellulare. Il fosfato di calcio invece è localizzato nelle ossa e nei denti e, sotto controllo ormonale, viene continuamente rimosso e dissociato. Il magnesio è presente nelle ossa sotto forma di fosfato di magnesio e stabilizza la conformazione molecolare degli acidi nucleici e della clorofilla. Gli ioni solfato agiscono sulle proteine, mentre lo ione bicarbonato è impiegato nel