Farmacologia dei farmaci biotecnologici - parte 1

Farmacologia dei farmaci biotecnologici

Prof. Candeletti

Introduzione

La farmacologia è al centro di apporti forniti da altre discipline. Per parlare di farmaci capaci di agire sulle funzioni cognitive o il comportamento è chiaro che dobbiamo fare riferimento alla psicologia. Se dobbiamo fare farmacologia veterinaria non possiamo fare a meno di conoscere la medicina veterinaria.

In questo ambito quelli che sono i grossi saperi che si immettono nella farmacologia sono quelli che avevamo accennato e sono la genetica e la genomica che ci permettono di ragionare nell’impiego, sviluppi, caratteristiche dei farmaci che sono da una parte costituiti da materiale genetico e dall’altra parte vanno ad incidere sul materiale genetico stesso. Farmacogenomica e biochimica contribuiscono allo sviluppo e impiego dei farmaci che stiamo per trattare.

Tornando allo sviluppo del sapere, possiamo tener presente che l’ampliamento rapido della farmacologia all’inizio del 900, c’è una prima area di pertinenza nella prima parte del secolo scorso che riguarda le conoscenze espresse riportate e sviluppate dalla farmacognosia cioè dalla conoscenza dei prodotti naturali, capacità di comprensione anche sulla base di competenze chimiche poi con lo sviluppo sofisticato delle capacità sintetiche della chimica accoppiata a miglioramento delle conoscenze di biochimica cellulare ecco che abbiamo la disponibilità dei farmaci moderni per andare poi a quelli che sono i farmaci biotecnologici.

La biochimica ci dice che esistono delle molecole, degli enzimi e delle proteine nella cellula che hanno attività enzimatica di manipolazione di certe molecole anche nucleotidiche cioè esistono delle ciclasi che ciclizzano delle molecole. Poi con lo sviluppo della biologia molecolare ha fatto sì che noi potessimo mettere le mani su altri meccanismi di produzione di quelle che sono le molecole importanti per lo sviluppo della cellula.

Non sono più farmaci capaci di inserirsi nei meccanismi di regolazione e funzionamento metabolico di una cellula ma hanno possibilità di sviluppare strumenti in grado di inserirsi nei meccanismi di produzione di queste molecole e quindi intervenire in processi fisiologici in maniera ancora più precoce con quella che è la terapia genica. Con i farmaci biotecnologici avrò la possibilità non più di modulare l’attività di un recettore ma quella di modulare acidi nucleici nel genoma.

Farmaci biologici e farmaci biotecnologici

I farmaci biotecnologici li possiamo accostare a farmaci biologici che siano molecole naturali derivanti da sistemi differenti come batteri (antibiotici), sono PA variamente utilizzati prodotti da organismi vegetali. Abbiamo molecole estratte (eparina) da animali.

Quelli biotecnologici sono sempre ottenuti da sistemi biologici geneticamente modificati. (Es. anticorpo monoclonale che agisce su specifico antigene sarà il frutto di una manipolazione di un organismo in modo da ottenere la specifica molecola che ci interessa. Per manipolare quell’organismo abbiamo manipolato i geni che producono quella molecola proteica.

In primo luogo come biotecnologici abbiamo gli anticorpi monoclonali, le proteine ricombinanti cioè derivanti da un gene costruito, molecole definite come immunotossine cioè capaci di essere riconosciute ed esercitare l’attività citotossica in maniera direzionata oppure sequenze nucleotidiche che influenzino il funzionamento delle nostre cellule.

Tecniche di DNA ricombinante

Le tecniche di DNA ricombinante possono essere usate o per produrre un miglioramento dell’individuo in cui si attua la modificazione ad esempio relativo agli organismi batterici oppure vengono sfruttate per clonare un gene (riprodurre una sequenza genica in maniera infinita) e ancora per inserire un gene clonato e replicato con PCR in una cellula ospite che produca a nostro vantaggio la molecola derivante da quello specifico gene che abbiamo ricombinato.

Quindi in pratica il DNA è ricombinante perché formato da porzioni diverse non naturalmente presenti in quella sequenza ma poste nella sequenza tramite una manipolazione operata dall’uomo e introdotte in altre cellule che possono essere cellule da usare come reattori per la produzione di molecole o cellule dell’organismo umano per modificarne il loro funzionamento.

Queste metodiche di DNA ricombinante consentono di trasferire sequenza di DNA (gene) non solo tra individui della stessa specie ma anche di specie diverse. Bisogna essere in grado per fare ciò di conoscere le sequenze geniche, di selezionare le sequenza di nostro interesse, di tagliare, isolare e maneggiare il gene in modo da inserirlo in un diverso costrutto, in una diversa sequenza nucleotidica.

Dovremmo essere in grado di unire il gene di nostro interesse a un vettore e quindi tramite il veicolatore immetterlo dentro una cellula ricevente al fine di ottenere dei risultati dovuti alla sua presenza. Ormai sono qualche decina d’anni che sono stati introdotti i primi farmaci biotecnologici e cioè l’insulina.

Finché la estraevamo era un semplice farmaco biologico utilizzabile ed estratto da un organismo vivente, attraverso gli step che abbiamo appena ricordato abbiamo imparato a farlo in maniera diversa, cioè: sappiamo qual è il gene che la produce, lo abbiamo identificato, lo abbiamo isolato e utilizzato un vettore e lo abbiamo immesso in una cellula diversa rispetto a quella da cui deriva e costretto la cellula in cui è inserito a produrre il suo prodotto proteico derivante dalla trascrizione di quel gene e la traduzione da parte dei ribosomi.

Si tratta di maneggiare consapevolmente quella che è una sequenza genica 3’5’3’ cioè una sequenza di nucleotidi cioè di basi azotate che contengono desossiribosio.

Dobbiamo essere in grado di tagliare il gene per isolare il gene di nostro interesse, dovremmo essere in grado di identificarlo facendolo accoppiare visto che la caratteristica delle catene di acidi nucleici è quella di potersi accoppiare coi legami a H formati dalle specifiche basi puriniche e adeniniche, poterlo ibridizzare con molecole specifiche e quindi poterlo riconoscere, fargli subire un certo destino piuttosto che un altro (intrappolarlo, distruggerlo) e oltre a taglio e ibridizzazione anche la clonazione cioè l’inserimento di questi frammenti di DNA in organismi diversi che useremo come veicoli per l’inserimento in altre cellule.

Sequenziamento e ibridizzazione

Per poter maneggiare le sequenza di DNA dovremmo essere capaci di definirne la struttura cioè l’esatta successione di nucleotidi ovvero se questo tratto di DNA in direzione 5’3’ è costituito da adenina, seguita da citosina… vedremo che il sequenziamento della sequenza nucleotidica di geni è un elemento determinante tra le tecnologie del DNA ricombinante per appunto effettuare la clonazione, manipolare i geni e riconoscere la loro presenza e metodiche che nel tempo si sono succedute per prima con approcci ormai classici come l’analisi della ibridizzazione di acidi nucleici immobilizzati su membrane con metodica che è la Southern o Northern.

Southern applicata alla sequenza di DNA e Northern per le sequenze di RNA mentre per le proteine si usa l’ibridizzazione con anticorpi che va sotto il nome di Western oppure ibridizzazione in situ che sfrutta l’ibridizzazione di acidi nucleici mediante sonde per quantificare e identificare l’espressione del gene in una fettina di tessuto per analizzare dove un determinato gene viene trascritto in RNA.

Enzimi di restrizione

Gli elementi cardine di questa manipolazione del DNA e metodica del DNA ricombinante arrivarono negli anni 70 con la scoperta degli enzimi di restrizione cioè enzimi prodotti da batteri che hanno una caratteristica ovvero sono enzimi litici e quindi scindono una sequenza nucleotidica al suo interno e non alle estremità.

Quindi questi enzimi di restrizione tagliano la doppia elica del DNA in corrispondenza di sequenza precise definite da struttura palindromica cioè che sono leggibili specularmente.

Es. un preciso enzima di restrizione è in grado di tagliare la doppia elica in maniera sfalsata cioè taglia il filamento in questo punto all’estremità di questa sequenza palindromica tra questa guanina e adenina seguita da questa precisa sequenza l’enzima EcoRI è in grado di tagliare questa elica di DNA in questo preciso punto e allo stesso momento di tagliare il filamento opposto nello stesso preciso punto. Questo perché l’enzima riconosce esattamente questa sequenza nucleotidica. Altri possono tagliare in sequenze e punti diversi.

Abbiamo a disposizione un’ampia serie di enzimi di restrizione. Quindi tagliando del DNA con un enzima piuttosto che con l’altro noi sapremo che avremo generato dei frammenti che alla estremità hanno esattamente questa sequenza genica.

Usando l’EcoRI (deriva da E. Choli) noi otterremo questo tipo di code, se usiamo EcoRII avremo un altro tipo ancora. Gli enzimi di restrizione prendono il nome dal batterio da cui sono stati isolati!

Questo ci consente di frammentare il DNA in frammenti di cui sappiamo esattamente l’estremità e quindi potremo poi come nell’operazione di clonaggio, inserire i frammenti ottenuti in altre sequenze di DNA in modo da inserirli in batteri, plasmidi, quindi inserirli in altri genomi.

Progetto Genoma Umano e NGS

Un altro elemento è poter sequenziare le sequenze ottenute cioè conoscere le esatte sequenza nucleotidiche che compongono i singoli frammenti ottenuti. Queste sono metodiche sviluppate nella seconda metà del secolo scorso. Per dare un’idea di come queste abbiano accelerato la possibilità di ottenere i farmaci biotecnologici basta vedere quello che è accaduto.

Negli anni 90 si partì con un progetto che interessò tutto il mondo ed è il Progetto Genoma Umano che sfruttava un metodo di sequenziamento ovvero il metodo di Sanger—> sfrutta l’accoppiamento di nucleotidi che in qualche modo provocavano la terminazione del lavoro della DNA polimerasi perché chimicamente modificati e quindi la possibilità di registrare un segnale fluorescente dell’ultimo nucleotide sintetizzato dalla polimerasi perché non poteva continuare la sintesi e quindi si otteneva fluorescenza con apposita sonda e facendo elettroforesi e analisi in PCR si poteva seguire l’esatta sequenza del frammento di interesse.

13 anni per sequenziare il genoma umano. Da quel momento c’è stato non solo il progetto di conoscenza della sequenza del genoma umano (che non contiene solo esoni ma anche altri elementi di regolazione), ma anche il progetto ENCODE che ha lo scopo di riconoscere i diversi elementi del genoma.

Questo lavoro è stato fatto con tecniche del tutto nuove che avvengono in cellule a flusso secondo tecniche più sofisticate come la NGS (next generation sequencing). La NGS viene usata per definire conoscere precise sequenze di materiale genetico che lavora in maniera miniaturizzata e termina con l’importante contributo della bioinformatica cioè con la manipolazione di informazioni matematico-numerico in maniera molto sofisticata.

Con la NGS si parte sempre dalla frammentazione del materiale genetico poi si passa attraverso una amplificazione di brevi sequenze (la solita PCR ma fatta su piastrine microscopiche che producono brevi filamenti), riconosciute, sequenziate sulla base delle molecole specifiche con cui sono state poste a contatto.

Questo dà una serie di segnali fluorescenti, numerosissimi che permettono di conoscere sequenze nucleotidiche di brevi sequenze e poi vengono lette matematiche, algoritmicamente e messe in sequenza plausibile secondo un sistema sviluppabile sono mediante una computerizzazione molto sofisticata.

In questo modo rispetto alla vecchia metodica di Sanger, la NGS riuscì a realizzare il sequenziamento del genoma umano non più in 13 anni ma in soli 5 mesi di lavoro e differenti laboratori con abbattimento di costo altissimo (3 mlrd $ vs 1,5 mln $).

Questa volta con il sequenziamento non andremo solo a riconoscere la sequenza di base ma individueremo i diversi elementi strutturali che compongono il genoma. Oggi non sono nemmeno più necessari i 5 mesi ma ne bastano 2 per conoscere l’esatta sequenza genica di un singolo individuo quindi conoscere le sue percepisce particolarità genetiche con un costo più basso rispetto al passato.

Farmacogenomica e reazioni ai farmaci

Perché esistono reazioni anomale ai farmaci di tipo idiosincrasico? Perché l’individuo era portatore di una particolarità genetica, cioè minor/maggior produzione di una proteina dipendente dall’assetto allelico nel suo genoma oppure poter avere alterazioni di singoli nucleotidi a livello del gene che produce RNA messaggero per quella proteina, alterazioni di singoli nucleotidi che possono dar luogo data la diversa traduzionali un enzima anomalo con efficienza differente e introdurre alterazioni nel metabolismo di certi farmaci che danno luogo a reazioni anomale rispetto alla popolazione generale.

Oggi se gli strumenti fin qui descritti ci consentono di capire bene le reazioni idiosincrasiche, ci permettono di riconoscer bene anche il preciso assetto genico di un individuo e la scelta di usare un farmaco piuttosto che l’altro per aggredire per esempio la sua specifica patologia. Siamo in grado di sapere se le cellule tumorali di quell’individuo esprimono determinati recettori e quindi io posso usare determinati anticorpi monoclonali.

È anche per questo che ripercorriamo le tecnologie di DNA ricombinante in modo da capire come queste influenzano sia la produzione di molecole farmaco in quanto nel 90% molecole proteiche e in più queste metodiche ci mettono nella condizione di usare in maniera mirata (farmacogenomica) gli specifici farmaci e i loro stessi prodotti in maniera biotecnologica.

Tecnologie omiche

Gli elementi di questa realtà biologica mutata puntano sia sulle metodiche di DNA ricombinante sia sull’analisi della realtà cellulare. Accanto allo sviluppo delle tecniche di DNA ricombinante si sono sviluppati dei settori della realtà cellulare che va sotto il nome di tecnologie omiche.

Con questo termine ci riferiamo alle diverse specialità di analisi della realtà biochimica della cellula che ne analizzano separatamente e approfonditamente aspetti diversi. Per cui possiamo dire che esiste la genomica cioè la capacità di manipolazione/riconoscimento delle sequenze di nucleotidi che ci mettono in condizione di poter rilevare alterazioni nella sequenza dei geni (mutazioni) che possono essere causa di patologie o per esempio causa di alterata risposta a certi farmaci mediante tecniche genomiche possiamo essere in grado di duplicare dei geni e formare molecole di DNA ricombinante tagliando e cucendo a piacere tratti di DNA.

Poi sapere anche, come i geni interagiscono tra di loro cioè come i prodotti dei singoli geni possono influenzare l’espressione di altri geni. Ma una cellula non è solo fatta di acidi nucleici ma anche di un preciso corredo enzimatico che può essere diverso da tessuto a tessuto ma che da individuo-individuo e analizzando il corredo facciamo quella che è una valutazione di fenotipo (metabolomica).

La metabolomica indaga su quelli che sono gli enzimi dell’organismo. La proteomica analizza il corredo proteico generale delle cellule di un individuo, analizza le molecole proteiche espresse, che caratteristiche hanno.

Sappiamo che l’RNA prodotto per copia del DNA viene poi espresso cioè variamente maneggiato dalla cellula e quindi esiste anche la trascrittomica cioè il prodotto della copia in RNA può subire splicing (rottura alternativa) e l’RNA prodotto può dar luogo a proteine differenti a seconda delle alterazioni che subisce dopo la trascrizione del DNA in RNA e prima che l’RNA maturo venga tradotto in proteina.

La trascrizione prevede l’esistenza di fattori di trascrizione e una regolazione della trascrivibilità del DNA in RNA, una maggior o minor leggibilità delle sequenza geniche, minor/maggior esposizione delle precise sequenze di geni al lavoro nella RNA polimerasi DNA dipendente quindi esiste sia una disciplina (cistromica) che va ad analizzare l’interazione tra fattori di trascrizione e genoma ed esiste anche l’epigenomica cioè la disciplina che si interessa dei fattori che facilitano la leggibilità del DNA e la trascrizione del DNA in RNA o invece che facilitarla, renderla più difficile.

A questi settori di discipline che producono una gran quantità di conoscenze e osservazioni diverse si aggiunge l’imprescindibile ruolo della analisi bioinformatica cioè della possibilità di manipolazione, correlazione e ordinamento di un’enorme quantità di dati biologici che da solo l’individuo non è in grado di valutare. L’osservazione non ci consentirebbe di mettere in luce le modificazioni più frequenti in un gene o comunque di valutare le differenze tra gli individui, questo è solo possibile con un computer.

Le tecnologie omiche alla fine ci danno un’analisi delle condizioni particolari della cellula a seguito di una certa stimolazione, in condizioni di una certa patologia, a seguito dell’introduzione di un elemento di perturbazione che può essere un farmaco e quindi capire a livello della cellula quali sono le conseguenze di tutto ciò ed eventuali differenze.

Quelli che vengono indicati come big data, dati in quantità enormi, vengono analizzati in maniera computerizzata per essere separati, letti in maniera produttiva. Le tecniche oggi di sviluppo di nuovi farmaci fanno ampio uso di queste metodiche perché lo studio del DNA (genomica) e la trascrittomica ci dà info su tutto il quadro genetico a livello di individuo (differenze tra individui, correlazione con patologie