Emocromocitometrico

Diagnostica di laboratorio

Esame emocromocitometrico

Esame che ci aiuta nel valutare la cellularità dei corpuscoli presenti nel sangue, in ematologia (scienza che studia la composizione del sangue e gli organi che lo producono), è il caposaldo. Test che valuta quantitativamente e qualitativamente gli elementi presenti nel sangue periferico.

Abbiamo bisogno di:

• Sangue in provetta con anticoagulante (EDTA il più usato). L’EDTA induce modifiche più tardive rispetto agli altri. Le provette sono diverse a seconda se sono sottovuoto o meno. È importante rispettare i volumi richiesti dalla provetta.

Quando andiamo a fare un prelievo di sangue, per poter ridurre al minimo l’errore pre-analitico (tempo che intercorre dal momento in cui il campione viene preso fino a quando non si mette nella provetta, in cui si possono sviluppare delle alterazioni), dobbiamo fare in modo che i tempi siano il più breve possibile. In primis perché tende a coagulare (in realtà, soprattutto nel gatto, anche la singola emostasi quando facciamo la compressione, fa sì che ci sia una aggregazione piastrinica, che sappiamo essere il primo evento che andrà ad attivare la cascata di coagulazione).

Per ridurre i tempi bisogna avere tutto pronto:

• Provetta
• Siringa (in base al volume da prelevare)
• Ago di calibro adeguato
• Vena di calibro adeguato

• In genere la Safena non è molto indicata perché tende a collassare, non cede molto sangue.
• Vena Cefalica (quasi gli stessi problemi) https://theory.labster.com/blood-tubes-it/
• Vena Giugulare (va bene per tutti!). È una tecnica che evita che l’animale associ la puntura, il fastidio dell’ago perché non lo vede.

• Buona pulizia del sito

Dobbiamo avere le provette pronte, perché per esempio, nel caso dell’emocromocitometrico i laboratori richiedono almeno 2 ml di sangue perché potrebbero avere la necessità di ripetere l’analisi più volte; con 1 ml si riescono a fare 3 ripetizioni al massimo. Può succedere che prepariamo la provetta da 2 ml, facciamo il prelievo e andiamo fuori vena e non riusciamo a prelevarne più di 1 mL. Quando prepariamo le provette, è meglio prepararci anche quella da 1 ml, perché così comunque riusciamo a mandare quella in lab, sperando che l’esame si riesca a fare.

Le prime provette a dover essere riempite sono quelle con anticoagulante; nel caso ci sia la provetta per l’analisi del plasma e profilo coagulativo, quindi per fare un profilo emostatico (per cui si usa come anticoagulante il sodio citrato), deve essere riempita per prima ed immediatamente centrifugata e separato il plasma. La provetta va agitata lentamente una volta messo il sangue. Poi possiamo riempire la provetta con EDTA per l’emocromo, si agita. Per ultimo quella per il biochimico (priva di anticoagulante).

Campione per emocromocitometrico oltre che la provetta in EDTA, prevede anche uno striscio a fresco per fare una valutazione morfologica, quindi una valutazione qualitativa (che lo strumento non fa!). Lo strumento conta le cellule, dice la dimensione, più o meno anche il contenuto (Hb se parliamo di g.rossi), differenzia la sottopopolazioni dei g.bianchi (non tutti lo fanno). È importante perché oltre ad aggiungere dati che lo strumento non ci dà, serve per confrontarci con quello che lo strumento ha letto perché potrebbero esserci delle letture errate.

Tecnica striscio

Tecnica striscio: prendiamo 2 vetrini. Su uno mettiamo una goccia di sangue e l’altro lo avviciniamo alla goccia; il sangue aderisce per capillarità e poi si striscia. Poi il materiale viene fissato. Si usano coloranti che prevedono una fissazione all’aria, per esempio il Diff-Quick.

Campioni di siero o plasma

I campioni di siero/plasma per il biochimico/profilo coagulativo, si prende il campione a secco e poi si mette a centrifugare per separare la parte corpuscolata dal siero (questo è privo di fattori di coagulazione, in particolare del Fibrinogeno!). Se parliamo di plasma, in esso rimangono tutti i fattori di coagulazione. Nel siero, tutti questi fattori sono dentro al coagulo che si forma sotto. https://healthy.thewom.it/esami-e-analisi/striscio-di-sangue-periferico-in-parole-semplici/

Se mettiamo a centrifugare un campione a secco per ottenere il siero, una volta che ha centrifugato si separa immediatamente il coagulo dal siero e se proviamo a muovere la provetta delicatamente non succedono grandi cose. Se invece centrifughiamo un campione in anticoagulante per ottenere il plasma, ci sarà la separazione, ma se agitiamo, si rimescola tutto.

Per ottenere il siero si usano giri e minuti più alti (3000 giri per 10 min).

I globuli rossi, anche se nel coagulo, sono vivi, quindi consumano glucosio! Se non separiamo subito il siero dalle cellule per poter fare il biochimico, ci dobbiamo aspettare che pian piano scenda la concentrazione di glucosio (in genere 7 mg/dl/h). Rischio di alterazione glicemia, se un paziente è ipoglicemico rischiamo di non saperlo!

Per il profilo coagulativo, il plasma va separato immediatamente perché nonostante ci sia il sodio citrato che è un anticoagulante che lega il Ca²⁺, la coagulazione può comunque avvenire; quindi non appena prelevato, va centrifugato e immediatamente separato il plasma e poi messo a refrigerare.

Il siero lo mettiamo nelle Eppendorf tramite pipette di plastica. È fondamentale identificare subito tutte le provette.

Colorazione striscio di sangue periferico

Colorazione striscio di sangue periferico: se lo leggiamo noi, possiamo colorarlo. In medicina di urgenza, ci sono determinati parametri “standard” da valutare sempre (glicemia, PCV-PT, enzimi epatici, azotemia e creatinina, pressione sanguigna, emogas analisi); dentro questo “pacchetto”, c’è anche la lettura dello striscio ematico.

Per la lettura dello striscio si usano le colorazioni tipo Romanowsky:

• Wright
• May-Gumwald-Giemsa
• Giemsa
• Wright-Giemsa
• Diff-Quik
• Hemacolor

Sono tutte colorazioni con fissazione all’aria, non con alcol!

La lettura dello striscio ematico è fondamentale perché insieme all’ematocrito, ci dice quale è la condizione ematologica del paziente; che sia o meno pura o una emergenza che determinare delle alterazioni allo striscio che ci aiutano ad interpretare il quadro e a gestire il caso clinico.

Lo striscio va fatto a fresco, perché se spediamo il campione, questo arriva in laboratorio con diverse alterazioni (i laboratori non fanno strisci su sangue del giorno dopo), quindi è possibile che ci siano degli artefatti.

Composizione cellulare del sangue periferico

G.bianchi o leucociti:

• Granulociti neutrofili, eosinofili, basofili
• Monociti
• Linfociti

Eritrociti

Trombociti

Eritrociti

Da 5 a 20 milioni per mm³ (o µL). Sono le cellule con vita media maggiore, da 70 a 160 gg. (nel cane 110-120 gg, 60-80 gg nel gatto). Motivo per cui, ha senso fare trasfusione quando c’è bisogno. Sono anucleati, ad eccezione di uccelli, rettili, pesci ed anfibi. Il nucleo lo perdono nel midollo prima di venir messi in circolo. Nella maggior parte delle specie hanno una forma discoidale e uno schiacciamento al centro.

Questo schiacciamento fa sì che nel centro si veda un pallore centrale legato alla presenza dell’emoglobina ridotta in quel punto. Così nel cane, ma anche in gatto e cavallo, ma la biconcavità in essi è leggermente ridotta. Nei camelidi sono ellissoidali.

Funzione: trasporto dell’O2 e della CO2, oltre che importante funzione tampone nel sangue.

La produzione parte da un Ruboblasto, Prorubrocita, Rubrocita [comparto proliferativo]; poi c’è il comparto di maturazione: Metarubrocita, espulsione del nucleo → messa in circolo di Policromotofilo (Reticolocita) ed Eritrociti maturi.

Nelle specie in cui i g.rossi sono nucleati il metarubrocita continuerà a dividersi finché non raggiunge le dimensioni adeguate per entrare in circolo. https://es.slideshare.net/juliocesarosoriobanos/hematopoyesis-43570174

Leucociti

Schema di Arneth (nell’immagine). Tutti prodotti nel midollo osseo, tranne i linfociti.

Distribuzione dei globuli bianchi: sono presenti in migliaia (3 zeri di meno dei g.rossi!!). Un cane in condizioni fisiologiche 5-6 mln di g.rossi e 5-6 mila G.bianchi.

Distribuzione:

• Pool proliferativo e maturativo nel midollo osseo → progenitori che proliferano, si dividono e poi maturano. Una volta maturate, una parte rimane nel midollo osseo a formare il pool di stoccaggio, una parte andrà in circolo, arriverà alla milza, altro punto di stoccaggio e la restante parte rimarrà in circolo; https://www.gastroepato.it/monocitopoiesi.htm
• Pool di stoccaggio: Midollo osseo e milza
• Vasi sanguigni:

• Pool circolante
• Pool marginale, è attaccato alla parete endoteliale.

Mentre i g.rossi svolgono la loro funzione all’interno del circolo e lì rimangono, i g.bianchi no, soprattutto i neutrofili. Il loro ruolo lo svolgono fuori dal comparto sanguigno, devono arrivare nei tessuti; quindi, non ha senso che siano in circolo; motivo per cui l’emivita è breve. https://www.microbiologiaitalia.it/immunologia/leucociti/

• Pool tissutale. Dal pool circolante, i g.bianchi vanno in circolo, piano piano poi aderiscono alle pareti e da lì escono per costituire il pool tissutale all’interno dei tessuti e delle cavità corporee.

Cane: Rapporto pool circolante/pool marginale=1/1

Gatto: Rapporto pool circolante/pool marginale=1/2

https://www.biopills.net/granulociti-polimorfonucleati/

Granulociti neutrofili

Granulociti neutrofili emivita: 6-7 h nel sangue, mentre nei tessuti fino a 2-3 gg fisiologicamente, se ci sono condizioni patologiche possono durare anche pochissime ore.

Tranne che nel bovino, solo i G.bianchi che hanno la maggior percentuale rispetto alle altre sottopopolazioni.

Struttura: si chiamano segmentati o polimorfonucleati perché hanno un nucleo segmentato (lobature), allungato e intensamente colorato. Le lobature sono da 2 a 5. Il citoplasma è tendenzialmente trasparente o può essere lievemente basofilo (lievemente rosato, in base alla specie) che contiene dei granuli neutrofili (da qui il nome) che spesso sono invisibili. https://www.atlanteistologia.unito.it/page-1924fad.html?xsl=tavole&xml=connettivi.Sangue&tavola=Neutrofili

Funzione: fagocitosi. Prima linea di difesa per l’organismo, indipendentemente dall’attivazione del sistema immunitario. Linea di difesa immediata, soprattutto parliamo di infezioni batteriche! Arrivano in tutti i siti tissutali dove c’è da fagocitare qualcosa, da un batterio a piccoli materiali come i detriti cellulari prodotti, per esempio, in un focolaio infiammatorio. Parliamo però, sempre, di piccole dimensioni.

Quando ci sono batteri, ci sono sempre neutrofili. Quindi se troviamo neutrofili in un sito tissutale, probabilmente ci sarà una infezione batterica (anche se non è l’unica causa, la flogosi non è sempre settica). È comunque una linea di difesa aspecifica.

NB. Tutta l’attività avviene nei capillari.

Eosinofili

Eosinofili emivita: 6-10 h in circolo e nei tessuti possono permanere per diversi giorni.

Percentuale bassa (3-5%).

Struttura: sono allungate e da non segmentate a 2-3 lobi. Il citoplasma è blu chiaro e ci sono granuli acidofili/eosinofili di diverse forme (proiettile nel gatto, rotondeggianti nel cane, perle rifrangenti nel cavallo).

Funzione: attivazione di istamina nei processi allergici, attività antiparassitaria. Ma hanno anche una attività fagocitica, anche se più specifica per i processi allergici e parassitari. Hanno anche un ruolo di modulazione nei processi di infiammazione tissutale. https://www.microbiologiaitalia.it/immunologia/leucociti/

Basofili

L’emivita è di alcuni giorni.

Sono i meno rappresentati (da 0,5 a 2%). Nello striscio si fa fatica a vederli, avendo una percentuale così bassa.

Funzione: al pari degli eosinofili intervengono nei processi allergici e parassitari. Liberazione di mediatori chimici dell’infiammazione contro allergeni, parassiti e varie sost.proteiche.

Sono simili agli eosinofili ma le granulazioni sono basofile. Il nucleo può essere o meno lobato. https://www.biopills.net/granulociti-polimorfonucleati/

Linfociti o cellule mononucleate

Linfociti (o cellule mononucleate) emivita: di alcuni giorni o ci sono quelli della memoria che vivono anni.

Sede di produzione:

• Linfonodi
• Milza
• BALT e GALT
• Timo → elementi precursori nella vita embrionale e neonatale
• Midollo → elementi precursori soprattutto nella vita embrionale. Nella vita neonatale, la produzione è affidata prevalentemente alle stazioni linfoidi (linfonodi, milza, balt e galt). Rimane una residua potenzialità di produzione, ma minima. Nel caso di ipoplasia o aplasia midollare, ci aspettiamo di vedere una carenza di neutrofili, basofili, poco gli eosinofili perché già sono pochi, ma non di linfociti! https://www.atlanteistologia.unito.it/page-197a678.html?xsl=tavole&xml=connettivi.Sangue&tavola=Linfociti

Valori medi % da 20 a 60. Sono i più rappresentati dopo i neutrofili, mentre nel bovino sono i più rappresentati.

Struttura: tondeggianti, costituite prevalentemente da nucleo che è tondeggiante e può presentare una piccola incisura. Il citoplasma è generalmente scarso, ad eccezione dei ruminanti, in cui le cellule tendono ad essere leggermente più grandi ed il citoplasma abbondante. Di colore lievemente basofilo.

Funzione: principali cellule coinvolte nella risposta immunitaria.

Monociti

Monociti https://www.atlanteistologia.unito.it/page-200c3c7.html?xsl=tavole&xml=connettivi.Sangue&tavola=https://www.atlanteistologia.unito.it/page-Monociti%20bis1993e3d.html?xsl=tavole&xml=connettivi.Sangue&tavola=Monociti

Emivita: in circolo 24-48 h. Sono i precursori dei macrofagi. Escono dal circolo e si trasformano in macrofagi. L’attività potenziale ce l’hanno anche in circolo, ma è massima una volta arrivati ai tessuti bersaglio. La permanenza nei tessuti sottoforma di macrofagi può durare da alcuni giorni a qualche mese.

Dopo i linfociti, sono i più rappresentati. Hanno lo stesso tipo di rappresentatività nel leucogramma.

Struttura: grandezza simile agli altri g.bianchi solo che appaiono più grandi allo striscio perché hanno una grande adesività al vetro. Il nucleo è polimorfo, può essere reniforme o meno. Presentano una cromatina meno addensata rispetto al neutrofilo. Citoplasma abbondante e tendenzialmente basofilo, bluastro e può contenere dei vacuoli. Può contenere anche dei materiali fagocitati. https://www.atlanteistologia.unito.it/page-198eeeb.html?xsl=tavole&xml=connettivi.Sangue&tavola=Linfociti%20bis

Funzione:

• Fagocitosi (arrivano non arrivano i neutrofili), sono in grado di fagocitare materiali più grandi e per far ciò li troviamo anche sottoforma di cellule multinucleate. Una volta avvenuta la fagocitosi, degenerano e rimangono dei detriti che poi vengono fagocitati dai macrofagi.
• Interazione con i linfociti perché sono APC.

https://www.atlanteistologia.unito.it/page-2015d0f.html?xsl=tavole&xml=connettivi.Sangue&tavola=Piastrine

Trombociti o piastrine

Trombociti (piastrine) emivita 3-5 giorni. Nelle specie domestiche in cui i g.rossi sono privi di nucleo, sono dei frammenti di citoplasma del Megacariocita. Nelle specie con G.rossi nucleati seguono il percorso dell’immissione in circolo di essi.

Funzioni: primi attori del processo coagulativo, appena c’è una lesione di un vaso piccola o grande che sia, arrivano ed innescano il processo coagulativo. Intervengono anche nei processi infiammatori e nella riparazione dei tessuti.

Sono presenti in centinaia di migliaia; un cane presenta 5 mln di g.rossi, 6 mila g.bianchi e 300 mila piastrine.

Struttura: grandezza variabile a seconda della specie e del loro grado di attivazione (attivate sono più grandi). Colore grigio-bluastro chiaro e presenti spesso in aggregato.

Conta delle cellule ematiche

Conta manuale: emocitometro (non si fa quasi più, ma può essere utile in determinate condizioni). Per la conta cellulare si utilizzano gli emocitometri (emocitometro di Burker). Il campione di sangue (in questo caso per la conta dei rossi) viene preso tramite una pipetta di Thoma che aspira una quantità nota di sangue in EDTA, una quantità nota di soluzione fisiologica per diluire un po' il campione e portarlo a concentrazioni note.

Si mette un vetrino coprioggetto sopra la superficie ed il campione viene inserito nello spazio compreso. Deve rimanere nello spazio di 0,1 mm². Sulle superfici di lettura troviamo dei reticoli 1 mm x 1 mm e contiamo i g.rossi presenti o in 20 quadratini A o 10 B e C che sono un po' più grandi; poi moltiplichiamo il numero per dei coefficienti noti e otteniamo il numero di g.rossi x mm³ o µL.

Per i bianchi si usa pipetta con volume inferiore, non si usa la fisiologica, ma una soluzione