Duplicazione del DNA

Caratteristiche della duplicazione del DNA

L'informazione deve essere passata, ma anche mantenuta dalla cellula madre, per cui il DNA si deve duplicare. Il meccanismo di duplicazione generale era già insito nel modello di Watson e Crick. In teoria, la replicazione del DNA potrebbe seguire tre meccanismi diversi:

Meccanismi di replicazione del DNA

Semiconservativo

Si ha una molecola di DNA composta da un filamento A e un filamento B, i quali faranno ciascuno da stampo per un nuovo filamento (A fa da stampo per B e B fa da stampo per A). Le due nuove molecole avranno dunque sia un filamento vecchio che un filamento nuovo. Questa teoria, da un punto di vista intuitivo, è probabilmente l'ipotesi più ragionevole, data la conformazione della molecola e la presenza dei legami a idrogeno.

Conservativo

Si ha una molecola di DNA in cui i filamenti originali A e B, una volta aperti, faranno da stampo per i nuovi filamenti, per poi andare nuovamente a richiudersi per riformare la molecola originale. I due filamenti appena sintetizzati saranno quindi parte integrante della nuova molecola di DNA.

Dispersivo

Con un dispendio energetico più alto, si ha una molecola di DNA in cui i filamenti A e B si duplicano a tratti e si rompono le single strand (le singole eliche A e B). Poi si formeranno delle molecole nuove, che porteranno la stessa identica informazione, disposta nello stesso identico ordine. Questo meccanismo è estremamente improbabile, poiché è necessaria parecchia energia per rompere i legami fosfodiesterici delle singole eliche, per poi permettere il loro successivo rimescolamento.

Esperimento di Meselson e Stahl, 1958

Questo esperimento definisce sperimentalmente come avviene la duplicazione del DNA. Gli scienziati utilizzarono l'ultracentrifugazione su gradienti di cesio solfato e cesio cloruro, per ultracentrifugare il DNA estratto da cellule di qualsiasi organismo. Hanno visto che, dopo parecchie ore, fino a 70, centrifugando a 100.000 rpm (giri al minuto), ottenevano il DNA che sedimentava ad una certa altezza nella provetta. Andando poi a colorare il DNA con il bromuro di etidio e poi illuminando con una lampada, erano in grado di vedere la densità di galleggiamento di quel DNA. Hanno inoltre notato che DNA di specie diverse hanno densità di galleggiamento diverse.

Per dimostrarlo, i ricercatori hanno preso delle cellule batteriche e le hanno fatte crescere per un certo numero di generazioni, per essere sicuri di avere una popolazione omogenea, in un terreno contenente un isotopo pesante dell'azoto (azoto 15). Questo processo è veloce, poiché la cellula batterica ha un tempo di duplicazione cellulare di circa 20 minuti. Dopodiché, da questo campione, hanno estratto il DNA e hanno creato un gradiente, valutando così un DNA pesante, in quanto l'azoto si lega alle basi azotate del DNA, appesantendolo. Al tempo 0, dopo che tutta la popolazione batterica si sarà nutrita di azoto 15, il loro DNA avrà una specifica densità di galleggiamento.

Ottengono dunque una sola banda, poiché la densità di galleggiamento del DNA è uguale per tutte le cellule. Un'aliquota di queste cellule, dopo questo esperimento, è stata messa in un terreno con presenza di azoto 14 (leggero) e dopo un tempo di permanenza nel terreno di 20 minuti è stato fatto un altro esperimento, con un'altra centrifugazione. Hanno notato che tutte le molecole di DNA, alla prima generazione, sono presenti in un'unica banda più leggera, e quindi meno densa, della prima banda.

Il fatto che ci sia un'unica banda esclude l'ipotesi del meccanismo conservativo, poiché una volta che la cellula contiene una molecola di DNA pesante e viene messa a contatto con un terreno di azoto leggero, avremo che ogni filamento fa da stampo per un filamento nuovo. Alla fine, però, il filamento pesante si legherebbe nuovamente con il filamento pesante e quello leggero, appena sintetizzato, si legherebbe con quello leggero. Quindi nell'esperimento già alla prima generazione avrebbero dovuto ottenere due bande e non una sola.

Questo esperimento non esclude il meccanismo dispersivo, poiché anche in quest'ultimo avremmo dovuto ottenere una sola banda, dato che le molecole sono formate da un patchwork di frammenti di DNA leggero e DNA pesante.

Meselson e Stahl vanno allora avanti con l'esperimento. Dopo altri 20 minuti, alla seconda generazione, prendono un altro campione di cellule, vi estraggono il DNA ed effettuano un'altra centrifugazione. Ottengono due bande: una ancora più leggera e una uguale a quella che avevano ottenuto al tempo 1. Questo esclude dunque, definitivamente, il meccanismo dispersivo. Esso infatti implica che ad ogni generazione debbano esserci molecole con sempre meno filamento pesante e con più filamento leggero, e inoltre le molecole saranno tutte uguali tra di loro. Dovrebbe dunque essere presente, ad ogni esperimento, una sola banda, sempre più leggera della precedente ma comunque unica.

Questo semplice esperimento prova che il meccanismo di duplicazione del DNA è semiconservativo. Abbiamo dunque che un filamento parentale è utilizzato da stampo per la sintesi di un filamento nuovo e le due molecole di nuova sintesi contengono ciascuna un filamento vecchio e un filamento nuovo.

Basi molecolari e origine della duplicazione del DNA

Per la duplicazione del DNA la cellula necessita di:

• Quattro desossiribonucleosidi trifosfati (dNTP): A, T, G, C
• Un filamento stampo
• Un innesco, ovvero un tratto di DNA che lascia il 3' -OH libero per l'aggiunta dei successivi dNTP, che saranno complementari al filamento stampo.

Tuttavia, tutto ciò può avvenire solamente in direzione 5' → 3'. Il filamento stampo sarà quindi di tipo 3' - 5' e un filamento di sintesi, che è l'innesco, che sarà di tipo 5'-3', con un -OH libero in posizione 3', dove potrà cominciare la sintesi. Il motore della duplicazione del DNA è l'idrolisi del pirofosfato, che dà l'energia necessaria per formare il legame fosfodiesterico. Le basi molecolari della duplicazione del DNA, nei procarioti e negli eucarioti, sono le stesse, mentre gli enzimi necessari alla duplicazione possono presentare nomi diversi, anche se fondamentalmente il meccanismo è lo stesso.

È stato notato che le origini di replicazioni non sono sequenze di DNA identiche tra di loro, anche se presentano delle proprietà comuni, ma sono sequenze relativamente piccole, che hanno dei motivi al loro interno che si ripetono. Sono spesso delle regioni ricche in A-T, poiché laddove inizia la replicazione del DNA si deve anche assistere alla denaturazione dello stesso, e le sequenze A-T sono più facilmente denaturabili con un minor dispendio di energia.

I procarioti hanno una sola origine di replicazione e la stessa avviene in modo bidirezionale. I due macchinari di duplicazione partono in unico punto e terminano la propria replicazione nel momento in cui si incontrano. Le molecole di DNA batterico, parentale e neosintetizzata, sono dunque concatenate e sarà necessaria l'azione della topoisomerasi per poterle disgiungere. Si dice dunque che i procarioti hanno un unico replicone, ovvero una forcella in cui si sa che inizia la replicazione.

Nei batteri, dove si trova un'unica origine di duplicazione bidirezionale, la velocità del movimento della forcella replicata è di circa 50k coppie di basi al minuto. I batteri hanno dei complessi, con all'interno anche la DNA polimerasi, molto più veloci di quelli eucariotici. Nel lievito si trovano 500 repliconi e il movimento della forcella è molto più lento dei procariotici, ovvero di 3,6k coppie di basi al minuto.

I batteri possono tranquillamente permettersi di compiere errori, dato che il loro tempo di replicazione è di circa 20 minuti. Duplicandosi in fretta, parecchi batteri avranno inserito all'interno di essi mutazioni, anche incompatibili con la vita, causando la morte del singolo. Ma ciò non è importante, poiché la specie batterica riesce comunque a sopravvivere anche con la presenza di numerosi individui mutati.

Le cellule eucariotiche hanno dei genomi notevolmente più grandi rispetto a quelli procariotici, si parla di 9 coppie di basi nel caso di genomi apolidi umani. I cromosomi sono lineari e ciascuno di essi è 3 ×10 una molecola di DNA double strand. Tra di loro presentano lunghezze diverse e non esiste una regola che dica quanto debba essere grande un cromosoma, anche se in media si trovano 100 milioni di paia di basi per ciascuno di essi. Deve esserci quindi almeno un'origine di replicazione, propria di ciascun cromosoma.

Inoltre, il macchinario di duplicazione ha una sua velocità. La velocità della DNA polimerasi infatti equivale a 2k basi al minuto, quindi per replicare un cromosoma umano partendo da un'unica origine di replicazione ci vorrebbero circa 35 giorni. Un ciclo cellulare, però, dura mediamente 24 h e a fase S dura 6-8 h. Non è dunque possibile che le DNA polimerasi possano impiegare 35 giorni per completare la fase S.

Fondamentalmente questo è dovuto ad un minor rischio di commettere errori grazie ad una velocità minore, nonostante le mutazioni siano necessarie per la sopravvivenza della specie e per l'esistenza della vita. Deve esserci la mutazione, ma la stessa deve poter permettere la sopravvivenza della specie. Tutto questo spiega la presenza di complessi polimerici molto più lenti, ma anche molto più accurati.

L'unica soluzione è che ciascun cromosoma lineare ha molte origini di replicazione, che non procedono in maniera sincrona. Infatti, negli eucarioti multicellulari sono state mappate tra le 20.000 e le 50.000 origini di replicazione. Esse non hanno una sequenza con senso specifica ed hanno anche una lunghezza variabile. Sono però tutte localizzate in siti più o meno specifici e hanno un'organizzazione simile della sequenza. Sono composte da elementi molto semplici che si ripetono e sono ricche in A-T.

Direzione della replicazione del DNA

Immagini autoradiografiche, ottenute marcando radioattivamente il DNA con una timidina triziata, mostrano che, partendo da un'origine di replicazione, la crescita è bidirezionale. Esistono origini precoci e altre più tardive. La replicazione del DNA parte, dunque, da punti specifici multipli e in modo bidirezionale, anche se effettivamente non si tratta di una legge universale, infatti non è vero per alcuni vermi a sangue freddo.

In un cromosoma vi sarà la progressiva apertura delle varie origini di replicazione e, a mano a mano, queste ultime si fondono. Una volta legati tra loro i vari frammenti di DNA, essi formeranno infine la single strand associata al filamento parentale, formando la nuova molecola di DNA. L'enzima che unirà i vari frammenti di DNA è la ligasi, che riesce a formare il legame fosfodiesterico senza dover portare i nucleotidi, dato che sono già presenti.

Fasi della duplicazione del DNA

Nel descrivere il meccanismo di replicazione del DNA è possibile distinguere tre fasi:

• Inizio
• Allungamento
• Termine

Pre-inizio o allestimento

È l'insieme di tutti gli eventi che permettono il riconoscimento delle origini di replicazione da parte di complessi proteici e la prima apertura della doppia elica. Nei procarioti, come in E.Coli, la sequenza di inizio è unica. Consiste di 245 bp, all'interno delle quali ci sono tre sequenze 13 mer e quattro sequenze 9 mer (mer = bp). Il modello proposto da Kornberg spiega come queste strutture interagiscono con il complesso proteico. In E.Coli si chiama proteina DnaA e interagisce con le sequenze ripetute di 9 mer. L'interazione tra questo complesso e le sequenze, una a seguito dell'altra, induce un ripiegamento della catena e quindi una forza di torsione, che rompe i legami a idrogeno a livello dei 13 mer. Specialmente i 13 mer sono ricchi in A e T, rendendo più semplice la rottura dei legami a idrogeno. Così si apre la bolla replicativa, in cui entrano subito le elicasi, che nei batteri si chiamano proteine DnaB, trasportate da un trasportatore, che è la DnaC. Nella forca replicativa entrano due elicasi, una per filamento, e scorrono in direzione 5' → 3', rompendo i legami a idrogeno che incontrano.