Diagnostica in patologia vascolare

Diagnostica in patologia vascolare

Proff. Giusti, Nacmias e Pepe

A.A. 2022/2023

Diagnostica in patologia vascolare

Prof.ssa Giusti

A.A. 2022/2023

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Diagnostica genetica delle dislipidemie (ipercolesterolemia familiare) – (Lez.1) 30.09

Per quanto riguarda il concetto di vascolare è un aggettivo riferito a formazioni anatomiche o processi morbosi o fisiologici correlati ai vasi sanguigni e linfatici e quindi la patologia vascolare sono quei processi patologici che interessano l’apparato vascolare. Chiaramente è un ambito molto vasto e per diagnostica in questo ambito infatti intendiamo tutto quello che sono indagini di laboratorio e strumentali (ecocardiografia, tomografia ecc…) che contribuiscono non di per sé, ma insieme all’analisi dei segni clinici e dei sintomi riferiti dal paziente, all’individuazione e quindi alla diagnosi di una malattia dell’apparato vascolare. Quindi un buon contesto lavorativo è quello in cui il clinico è in grado di chiedere e condurre indagini appropriate e le conoscenze di chi vi lavora sono così elevate da arrivare a dire “no stai chiedendo un’analisi inappropriata”.

Diagnostica genetica delle dislipidemie

Iniziamo ora a parlare della diagnostica genetica delle dislipidemie, in particolare nell’ambito dell’ipercolesterolemia familiare. Nello specifico è chiaro che l’ipercolesterolemia si associa alla malattia coronarica, quindi con alto colesterolo bisogna avere attenzione sull’aterosclerosi perché gran parte della patologia sostenuta da questo aspetto colpisce l’albero coronarico con quello che ne consegue di malattia ischemica coronarica. E sappiamo che con questo fattore di rischio, abbassandolo posso ridurre il rischio di malattia coronarica, e sappiamo soprattutto che siamo capaci di modulare questo fattore di rischio, infatti abbiamo un armamentario farmacologico che ci permette di essere efficaci in questo contesto. Il beneficio che infatti posso trarre è ritardare l’insorgenza di malattia coronarica, o addirittura annullare ogni rischio.

Ricordiamo che il colesterolo significa un grande capitolo in cui all’interno abbiamo le HDL, LDL, poi sappiamo bene come le lipoproteine possano avere significati di aterogenesi molto diversi, per cui di tutto questo mondo abbiamo la quasi totalità che creano rischio aterogenico e aterosclerotico, salvo le HDL che invece hanno un ruolo protettivo nei confronti dell’aterosclerosi e della malattia coronarica. La struttura delle lipoproteine è importante da rammentare, ovvero è fatta da una superficie monostrato di fosfolipidi e colesterolo libero, sappiamo che in questo strato sono accolte anche apo-lipoproteine, importantissime nel metabolismo stesso delle lipoproteine e poi abbiamo un core idrofobico di trigliceridi e esteri del colesterolo. Spesso siamo portati a distinguere il mondo tra LDL e HDL, ma in realtà come abbiamo detto il mondo delle lipoproteine aterosclerotiche è molto più vasto e quindi possiamo distinguere questo mondo in HDL vs tutte le altre lipoproteine.

Valori ideali di colesterolemia

I valori ideali di colesterolemia di un soggetto privo di alcun fattore di rischio cardiovascolare (infatti un valore alto in un fumatore ha un significato, un valore alto in un soggetto senza altri fattori di rischio aggiunti ha un significato del tutto differente) o con un solo fattore corrispondono a 190 mg/dl, ma se i soggetti hanno più fattori di rischio allora tanto più questi fattori di rischio sono maggiori e allora più sono considerabili patologici anche valori bassi, per esempio chi ha 1 fattore di rischio il valore deve essere di 155 mg/dl, dopodiché per esempio in caso di diabete <70 mg/dL, mentre valori di HDL superiori a 60 mg/dL indica un fattore protettivo (in genere nel mondo anglosassone il colesterolo si indica in mmol/L, ma in Italia classicamente si parla di mg/dL, per cui ci sono tabelle di conversione che ci aiutano).

Ipercolesterolemia familiare

Dopo questa parte introduttiva vediamo allora un esempio di patologia di dislipidemia, ovvero l’ipercolesterolemia familiare, per cui si intende un disordine genetico autosomico dominante salvo pochissime forme, caratterizzato da alti livelli di colesterolo plasmatici e che incrementa il rischio di aterosclerosi e non è un disordine raro e lo capiamo perché ha una prevalenza di 1:250 (la forma eterozigotica), quando con raro si intende una frequenza di 1:5.000. Quindi riassumendo siamo nel caso di una condizione genetica complessa perché ha più fattori che la modulano, ma nonostante sia genica è una malattia non rara. Il fatto che i fattori che la determinino siano modulabili è necessario affinché si parli del senso della diagnostica, ovvero la diagnostica ha senso solo e soltanto se questa mi permette poi di agire e modulare lo stato della malattia, per esempio l’intervento terapeutico, chirurgico ecc… Là dove conoscere un’informazione non mi porta niente in più se non conoscenza, è utile per la ricerca, ma poi non riesco a applicarla nella pratica diagnostica, soprattutto sostenuta dal sistema sanitario nazionale.

Come detto la forma eterozigotica ha la prevalenza di 1:250, ha una penetranza di circa 90% ed è una forma rara solo quando la penso in forma omozigote, forma rara molto impattante, con una incidenza molto maggiore di circa 1:160.000/300.000. È ad oggi noto che se un soggetto anche eterozigote non viene trattato ha una probabilità altissima di malattia coronarica nell’uomo prima dei 55 anni e nella donna prima dei 60 anni e di questi circa il 50% ha un rischio di morte, per altro in certi pazienti anche in periodo adolescenziale. È poi una patologia che riguarda indistintamente maschi e femmine e non è una condizione molto rara perché solo in Italia ci sono sicuramente più di 300.000 soggetti affetti, mentre quasi 37 milioni nel mondo. In altre popolazioni per altro per effetto fondatore importante ci sono anche molti più soggetti. E se lascio queste forme come non trattate arrivano a rischio di eventi a età tanto più precoce e tanto più precoce invece è la diagnostica e l’inizio della terapia e tanto più aumenta il periodo libero da comparsa di eventi patologici.

Trattamento e riconoscimento del paziente

Il trattamento è fatto da classi di farmaci vasti come cambio di stile di vita, statine, Ezetimide, inibitori del PCSK9. Tuttavia questo deve essere percepito, quindi come in ogni patologia si può fare tanto di più, tanto più questa patologia è riconoscibile, e questo è molto importante e impattante, soprattutto la scarsa consapevolezza e scarso riconoscimento del paziente non è solo perché nella popolazione generale non è tanto diffusa la sensibilità della condizione patologica, ma anche inconsapevolezza dei clinici per cui spesso si pensa di avere l’ennesimo paziente con un po’ di colesterolo alto, ma non è così, perché anche a parità di livelli di colesterolo, l’avere una forma geneticamente determinata conferisce un rischio maggiore sempre di malattie cardiovascolari. Addirittura da dati del 2013 si stima che in Italia solo l’1% dei pazienti che si stima sulla base della probabilità di 1:250 abbiano questa patologia hanno una diagnosi per ipercolesterolemia familiare, e questo per una scarsissima sensibilità della popolazione, mentre in Olanda, quasi il 71% dei pazienti stimati hanno una diagnosi, frutto di una campagna di screening a tappeto su tutta la - 2 - popolazione, anche mediante mezzi diagnostici seppur molto semplici ma che suggeriscono i pazienti da inviare alla diagnosi. E tutto questo ha dimostrato che nonostante questo abbia portato in Olanda un grande investimento economico da parte del paese, poi ha portato un grande abbattimento della spesa sanitaria, con un rapporto costo/benefici enormemente positivo.

Varianti genetiche e LDL

Bisogna immaginare che questi soggetti hanno valori di LDL aumentati perché hanno varianti genetiche soprattutto nei geni codificanti ai recettori alle LDL, nei geni codificanti per l’apolipoproteina B che compone la struttura delle lipoproteine LDL, e i geni codificanti per il metabolismo delle LDL (come l’enzima PCSK9). Queste varianti quindi portano ad aumentare i livelli circolanti di LDL che possono comportare aterosclerosi con manifestazioni come xantomi tendinei, xantelasma, arcus corneae ecc… Queste manifestazioni si vedono ad oggi sempre meno perché sempre più si riesce a fare diagnosi precoce. Altro rischio importante è anche sul cuore con malattia ischemica coronarica.

È importante però sapere le varianti dove cadono, in che percentuali di pazienti li troviamo, perché a seconda della strategia di laboratorio posso decidere da che gene iniziare a fare le analisi. Ormai è noto che nella maggior parte dei pazienti le mutazioni avvengono nel recettore delle LDL, circa 60-80%, poi nel gene di Apo-B (1-10%) e poi su PCSK9 in 0-3%. Avanza però un 20-40% in cui non si trovano varianti in nessuna di queste 4 categorie. Verosimilmente si può pensare che siano forme recessive più rare con frequenza minore dell’1% come nel gene LDL-RAP1, oppure cadono in altre famiglie di geni di cui ancora in certi casi non noti, oppure poi sennò deve venire in mente la possibilità di essere di fronte a forme poligeniche sostenute da varianti rare e non rare che nel momento in cui sono in forma combinata possono dare un fenotipo analogo alle forme monogeniche tradizionali. Questo significa essere di fronte a pazienti che vedono giustificata la loro condizione patologica non da una variante maggiore in un gene con alta penetranza, bensì vedono l’effetto combinato di tante varianti addirittura comuni nella popolazione, di cui ciascuna di per sé porta un effetto modesto di rischio, per cui da sole fanno poco, ma se sono presenti sfortunatamente insieme conferiscono un rischio di malattia molto alto.

Regioni hotspot e tecniche NGS

Altro concetto da avere in mente è se abbiamo una regione hotspot che viene spesso bersagliata, è noto che l’esone 4 delle LDL-R (receptor) sia più frequentemente colpito da mutazioni ma è anche vero che non è il solo, quindi non esistono regioni hotspot. Un discorso simile è traslabile anche in Apo-B con l’esone 26 che vede mutazioni più frequentemente, ma vedono mutazioni anche gli altri esoni, per cui non abbiamo una regione hotspot, analogo per PCSK9. E questo ha impattato molto nella diagnostica per esempio con tecniche NGS, se infatti abbiamo una regione hotspot questo mi fa selezionare una regione piccola che mi avere grandi vantaggi perché se ho un target piccolo posso allora analizzare contemporaneamente più soggetti.

Score diagnostici e criteri clinici

Però è importante capire quali sono i soggetti da dover analizzare, ovvero quali soggetti possono essere classificati con potenziale ipercolesterolemia familiare? Si è visto che è molto funzionale farlo dove la probabilità di incorrere in un soggetto affetto è elevata, portando a sviluppare tutta una serie di strategie diagnostiche, ovvero degli score e criteri clinici di laboratorio basati su criteri semplici per trovare quei soggetti che hanno una probabilità o improbabilità di avere la malattia. Per esempio uno score si basa su tre stratificazioni, una è la stratificazione dei soggetti per età, poi stratificazione per familiarità, e poi anche i livelli di colesterolo, quindi con questi tre semplici parametri possiamo trovare la probabilità di essere davanti a un paziente affetto.

Un altro caso di score, il più utilizzato è quello che è stato usato in Olanda come si diceva prima, detto Dutch score, per cui i criteri diagnostici in questo caso sono la storia familiare, la storia clinica, la storia fisica ovvero presenza di eventuali manifestazioni, livelli di colesterolo e la presenza di varianti genetiche note come causative della malattia. E sono attribuiti dei punteggi per la presenza o meno e in che entità di questi criteri che sommandoci ci danno dei risultati, ovvero sopra a 8 è un soggetto con ipercolesterolemia, c’è alta probabilità se è tra 6-8, mentre tra 3-5 è possibile anche se meno probabile rispetto che tra 6 e 8, ed infine tra 0-2 abbiamo una certa tranquillità di non avere un paziente affetto.

Screening a cascata

Tutto questo è fondamentale per fare uno screening che il medico clinico stesso può usare per trattare il paziente per fare prevenzione primaria, ovvero l’idea è di sensibilizzare sempre più i medici clinici nell’uso di questi score. Tutto questo perché tutto quello che facciamo si fa nell’idea di - 3 - poter applicare uno screening a cascata, ovvero significa talvolta iniziare da un soggetto che va in prevenzione secondaria, ovvero che è già dal medico perché malato, ma da qui posso andare a cercare una variante e posso andare a trovare questa stessa variante nei soggetti nella generazione successiva di quel paziente, quindi nei figli, che casomai ancora non sono a conoscenza di essere affetti dall’ipercolesterolemia familiare, ma la vado a cercare per fare prevenzione estremamente precoce, per iniziare eventuali trattamenti molto a monte.

Fenotipo, varianti causative e forme poligeniche

Dicevamo che a valle di quello che possiamo fare ci possiamo trovare in condizioni in cui abbiamo un fenotipo che corrisponde alla presenza di varianti causative, ma possiamo anche trovarci nel caso in cui non abbiamo manifestazioni cliniche ma abbiamo la variante causativa, che può succedere nei pazienti con familiarità che ancora non manifestano il fenotipo, oppure poi abbiamo pazienti con diagnosi ma senza varianti, quel mondo che poi apre anche alla ricerca e a tutte quelle considerazioni che hanno portato a trovare le forme poligeniche della malattia. Questa osservazione delle forme poligeniche venne in mente abbastanza presto con l’avvento degli studi di genome wide (studi di associazione in cui si cerca associazione tra mutazioni di alcuni geni con malattia e si usano marcatori genetici come gli SNPs tra i più antichi) in cui si usavano migliaia o milioni di SNPs dispersi lungo tutto l’esoma e genoma per fare studi di associazione tra una coorte di soggetti patologici per infarto di miocardio e una coorte comparabile per sesso, età e etnia totalmente sani.

E questi studi condotti per la dislipidemia in generale, non necessariamente ipercolesterolemia familiare, hanno fatto vedere che anche molti SNPs si associavano alla deregolazione dei livelli di colesterolo, ma non solo, hanno anche fatto vedere che quanto più si sommano alleli di rischio, quanto più aumenta il rischio dato dai livelli di colesterolo. Quindi già in qualche modo questi studi un’evidenza ce l’hanno data, facendo capire quanto importante fosse l’insieme delle varianti nel loro effetto combinato, a prescindere dal fatto che singolarmente invece hanno un peso davvero minimo. Da questi studi, datati 2008, nel 2013 a fronte di tanti dati accumulati una ricercatrice sviluppò uno score per inquadrare almeno una parte di quelle forme poligeniche che non trovavano nelle varianti tradizionali, come LDL-receptor, ApoB e PCSK9, l’origine genetica della malattia. Venne allora sviluppato questo score su decili di alleli di rischio, quindi tanto più sono il numero di varianti che ricadono in quel singolo soggetto, tanto più aumenta il rischio di avere livelli di LDL superiori al valore di riferimento per l’ipercolesterolemia familiare.

Per cui questo ha portato a definire una curva Gaussiana in cui all’apice abbiamo che nella maggior parte dei casi abbiamo mutazioni nei geni maggiori citati prima nelle varianti tradizionali, nei limiti della curva abbiamo invece tutti i vari polimorfismi responsabili delle forme poligeniche.

Trial clinico e diagnosi a cascata

Allora in un paziente vedendo il trial clinico che si fa è intanto un primo inquadramento clinico in cui si guardano le manifestazioni cliniche del paziente, andando ad applicare poi lo score scelto per collocarci nella probabilità o rischio di malattia e poi possiamo decidere se mandare in diagnosi. Dunque si fa una valutazione del profilo anche biochimico del paziente, dosando il colesterolo LDL, HDL, trigliceridi e tutto quello che caratterizza il profilo lipidico e si raccolgono le stesse informazioni anche nella famiglia. Questo può esser fatto se già la diagnosi c’è per fare come detto prima la diagnosi a cascata, oppure perché lo score ci dice che potremmo essere davanti a un paziente affetto.

Dunque la prima cosa che ci serve per essere guidati è la guida clinica derivante soprattutto dal Dutch score come score clinico per darci informazioni di diagnosi certa, oppure alta probabilità, possibilità, oppure addirittura se il punteggio è molto basso tra 0 e 2 invece si ha un’alta confidenza che sia un soggetto che non merita ulteriori analisi perché non ha caratteristiche ci fanno pensare che sia un soggetto che necessita di un approfondimento per approfondire e definire la diagnosi che invece è da fare in caso di possibilità o alta probabilità. È importante fare questa distinzione perché sono anche diverse le necessità di erogazione di un test, per esempio se ho già malattia conclamata non ho bisogno della genetica per la diagnosi, perché la diagnosi è già stata fatta, allora in questo caso il clinico è già in condizione di andare avanti nella terapia.

Allora la diagnosi genetica in un paziente che ho già diagnosticato è fondamentale se soprattutto quel paziente ha dei figli, tanto più se sono molto giovani, perché potrebbero ancora non aver del tutto manifestato quei livelli di colesterolo e manifestazioni cliniche che potrebbero preoccupare solo in presenza di una importante familiarità. Per cui ha senso investire in test genetici in un paziente già diagnosticato se può essere un vantaggio nei test a cascata familiare. Nel resto dei casi, se il test genetico mi serve a fare diagnosi è invece importante a scopo terapeutico scegliendo terapie che possono essere significativamente diverse.

Test genetico e analisi mutazionale

Allora quando entriamo nell’ottica di dover fare un test genetico dobbiamo entrare nelle dinamiche di un test di laboratorio per diagnosi genetica. Per esempio pensiamo di fare un test genetico per l’ipercolesterolemia familiare in cui esploriamo con sequenziamento e tecniche proprie dell’analisi - 4 - mutazionale vari loci gen