Colture cellulari

Colture cellulari

Tecnica che implica l’isolamento e il mantenimento in vitro di cellule isolate da tessuti o

organi. Strumento di indagine per evitare etici e morali legati alla sperimentazione animale.

Costituiscono un sistema modello semplificato e riproducibile per lo studio della biochimica e

della fisiologia cellulare. I vantaggi sono:

●​ Sistemi semplificati e altamente riproducibili

●​ Consentono l’analisi di meccanismi cellulari e molecolari

●​ Controllo ambientale

●​ Economicità e rapidità di risposta

●​ Disponibilità

Svantaggi:

●​ Sistemi semplificati rispetto ad un organismo integrato

●​ Condizioni di esposizione alle sostanze diverse da quelle in vivo

●​ Difficoltà di correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo

●​ Le sostanze somministrate possono interagire con il terreno di coltura

Perché coltivare le cellule?

Studiare il metabolismo, proliferazione, differenziamento, migrazione, morte cellulare

(cancerogenesi, apoptosi…). Studio dei meccanismi di azione dei fattori di crescita,

citochine, ormoni e farmaci. Studi di citotossicitá, studio dei processi intracellulari (sintesi

proteica e meccanismi di traduzione dei segnali). Studi di genetica, della struttura e della

funzione dei geni (analisi del cariotipo). Studio dei meccanismi molecolari/cellulari coinvolti

nelle funzioni cellulari. Strumenti per la biologia molecolare (amplificazione genica,

produzione estrazione di proteine), produzione di tessuti per trapianti, ricerca ecc. Strumenti

per la terapia (terapia cellulare, cellule staminali, terapia genica, rigenerazione tessutale,

produzione di farmaci biotecnologici.

Tappe per ottenere una linea cellulare

1.​ Prelievo delle cellule da un campione (organo, embrioni)

2.​ Dissezione meccanica: in cui le cellule vengono separate senza l’uso di agenti

chimici o enzimi.

3.​ Disgregazione enzimatica: trattamento con tripsina (o altro enzima) per eliminare i

contatti tra le cellule.

4.​ Inibitore per bloccare la digestione enzimatica

5.​ Controllo della vitalità cellulare ( grazie al trypan blu e)

6.​ Trasferimento in coltura, dove avremo proliferazione ed eventuale adesione al

substrato. Le colture cellulari possono essere seminate in piastra petri oppure in

sospensione.

7.​ Coltura primaria: proliferazione delle cellule che vanno incontro a successivi

cambiamenti ( si modificano ad esempio i rapporti di frequenza tra le cellule).

Raggiungimento della prima confluenza in cui il monostrato presenta una notevole

somiglianza con il tessuto di origine.

8.​ Sotto coltura o passaggio

9.​ Linea cellulare che può essere finita o continua.

Evoluzione di una linea cellulare in

coltura

La coltura primaria è caratterizzata da un tempo di

duplicazione lento, che aumenta notevolmente nei

successivi passaggi in coltura, quando si parla di

linea cellulare primaria (seconda fase). Nella terza

fase si nota la senescenza, con tempi di

duplicazione progressivamente più lunghi (sino alla

morte). Arriviamo a una linea cellulare secondaria a

vita finita, a meno che (porzione arancione) non

intervenga una trasformazione, a produrre una linea

cellulare secondaria immortalizzata (a vita infinita),

in grado di replicarsi indefinitamente.

Colture cellulari

Coltura primaria: una coltura iniziata da un espianto di cellule, tessuti od organi prelevati da

un organismo. Una coltura si definisce primaria sino alla sua prima subcoltura: a questo

punto diventa linea cellulare primaria.

Subcoltura: raccolta di cellule da una coltura e loro utilizzo per dare inizio ad una nuova

coltura. Questo termine è sinonimo di passaggio.

Linea cellulare: una coltura cellulare che emerge da un espianto primario dopo la prima

sub-coltura. La linea cellulare implica che le colture che ne derivano siano costituite da

cellule originariamente presenti nella coltura primaria.

Linee cellulari a vita finita: resistono in coltura un numero limitato di cicli cellulari; le linee

cellulari che crescono in monostrato risentono dell’inibizione da contatto; fortemente

dipendenti da fattori di crescita presenti nel siero.

Linee cellulari immortalizzate (continue o trasformate): hanno origine da mutazioni

(spontanee o indotte con agenti chimici, fisici o biologici) a partire da colture primarie o da

linee cellulari a vita finita; possono essere ottenute anche da tumori. Presentano minore

dipendenza da fattori del siero e minore inibizione da contatto.

Telomerasi

Enzima che mantiene e stabilizza i telomeri, strutture che terminano i cromosomi

proteggendoli dalla degradazione progressiva che si verifica dopo ogni divisione cellulare.

La telomerasi è una trascrittasi inversa che aggiunge ripetizioni telomeri che alle estremità 3’

dei cromosomi liberati. Dopo vari ciclo di divisione, i telomeri di una cellula normale si

consumano fino ad impedire la replicazione del dna. La cellula diventa secernente, perde la

capacità di dividersi. Nelle cellule germinali, staminali, ed in numerose cellule maligne, la

sovra-espressione della telomerasi mantiene i telomeri, permettendo la continua divisione

cellulare.

Aggiungendo questi telomeri dei cromosomi li protegge dallo sfilacciamento e impedisce

anche a enzimi coinvolti nella degradazione del dna di riconoscere queste parti come danni

da riparare. Man mano che le cellule si dividono, il telomero man mano si accorcia fino ad

esaurirsi. Quando si esaurisce la cellula non può più duplicare e va in morte cellulare

programmata. La lunghezza dei telomeri in un individuo giovane (15-20 kb) sono molto più

accentuati rispetto ai telomeri presenti nelle cellule somatiche di individui anziani (marcatore

surrogato dell’invecchiamento). Per qualsiasi ragione (spontanea o indotta) si può attivare la

telomerasi e quindi anche se i telomeri sono accorciati, l’enzima andrà ad aggiungere dei

frammenti ripetitivi per ripristinare il telomero. Se si attiva viene bloccata la senescenza e si

ha la immortalizzazione, la cellula dà vita finita si trasforma in una cellula immortale.

Trasformazione di una linea cellulare

Possono subentrare anche altre modificazioni a livello del dna. Non ci sarà l’inibizione da

contatto (fenomeno biologico in cui la proliferazione cellulare si arresta quando le cellule

entrano in contatto tra di loro) e una volta che le cellule hanno fatto il loro tappeto, si

osservano dei foci di trasformazione, ovvero delle clusters di cellule simili a quelle tumorali,

che non risentono dell’inibizione da contatto. La prima linea cellulare umana ottenuta è stata

chiamata Hela, cellule uterine, cellule che sono state separate e coltivate, erano cellule

immortalizzate, separate nel 1951. Modello per andare a studiare quello che accade nelle

cellule tumorali, le mutazioni che attivano il gene della telomerasi e anche quelle che

attivano altri processi neurologici che portano alla perdita di inibizione da contatto. Vi è una

correlazione tra un virus che era presente in questa linea cellulare (pappiloma virus), che

andava a immortalizzare queste cellule.

Colture cellulari

Parliamo di un terreno di coltura dove sono presenti nutrienti, sali, soluti, che sono

necessarie per la vita delle cellule. Dobbiamo trattarle in sterilità, in modo da riproporre

l’ambiente presente nei tessuti dove sono state separate. Dobbiamo avere una Kappa in cui

sia possibile manipolare le cellule in sterilità. Anche i contenitori (piastre provette) devono

essere sterili.

Esistono due tipi di colture cellulari: Adese (fibroblasti, epiteliali) e in sospensione (cellule del

sangue). Le cellule Adele crescono aderendo al supporto in cui sono state seminate (cioè

sulla parete della fiasca) crescono formando monostrati (se sono sane, in quanto risentono

dell’inibizione da contatto) o pluristrati (se sono tumorali e quindi non risentono dell’inibizione

da contatto). Le cellule in sospensione sono cellule che non crescono adese alla parete

della fiasca, ma sospese nel terreno di coltura senza aderire ad alcun supporto. Le cellule

adese hanno la tendenza di schiacciarsi tra loro e occupare una parte del contenitore, a

facilitare questo contatto ci sono molecole e proteine che favoriscono l’adesione. Quando si

parla di colture bidimensionali, sé queste sono cellule che crescono in monostrato

cresceranno in due dimensioni e non in alto. La morfologia delle due è differente alcune

sono affusolate appiattite lungo la base del contenitore, quelle in sospensioni sono circolari

perché non si attaccano, solo a seguito della forza di gravità si attaccheranno al contenitore.

Queste possono essere delle monocolture, abbiamo un tipo di cellule.

Co-colture cellulari

Interessano due o più popolazioni di cellule differenti, che possono essere messe a contatto

l’una con l’altra in diversi modi. Ad esempio fibroblasti e cellule e doteliali; cellule stromali e

linfociti; epatociti e fibroblasti; cellule di Schwann e neuroni). Questo ci permette di studiare

in vitro le interazioni che avvengono tra i diversi tipi cellulari appartenenti ad un determinato

tessuto e quindi ci permette di acquisire conoscenze sulla complessità fisiologica e

patologica dei vari tessuti.

Possiamo far sì che queste due popolazioni comunichino tra loro in maniera indiretta: le due

popolazioni non interagiscono fisicamente ma si scambiano, attraverso una membrana

porosa a cui è appoggiata una delle due popolazioni, le varie biomolecole. A loro volta

ricevendo un segnale dalle altre possono rispondere secernendo altri fattori che possono

influenzare le cellule dell’altra popolazione. Oppure possono comunicare in maniera diretta: i

due tipi cellulari sono a contatto l’una con l’altra, quindi oltre alle biomolecole abbiamo anche

l’interazione dei recettori delle due popolazioni, aumenta molto la complessità.

Usando un farmaco nei due tipi di colture cellulari tumorali. Nelle co-colture cellulari indirette

a quella concentrazione dava una mortalità del 30% ma se uso lo stesso farmaco a stessa

concentrazione in una coltura diretta avevo un 10/15%. Abbiamo una maggior interazione di

cellule. Se lo usavo solo nelle cellule tumorali avevo una mortalità di 60%. L’interazione con

cellule tumorali e altre cellule, fa sì che protegga le cellule tumorali dell'effetto citotossico del

farmaco.

Un altro tipo di coltura indiretta è quella di tenere in due contenitori separati le due

popolazioni cellulari e dopo prelevare un po’ di terreno di una coltura e metterlo nell’altra. Le

molecole così vanno sull’altro tipo cellulare, ma la popolazione 2 una volta stimolata

secernerà delle biomolecole che andranno nella popolazione 1. Abbiamo uno scambio di

fattori più complesso perché il tipo cellulare verde emetterà dei fattori che andranno a

perdersi nella complessi di interazione delle biomolecole input output delle due popolazioni.

Le co-colture tridimensionali si distinguono perché se le seminano in placcature (struttura

gelatinosa) che simulano quelle dell’organismo, le cellule possono proliferare e muoversi

nelle tre dimensioni. Più i terreni e le interazioni si avvicinano alla realtà più avremo una

maggior situazi