Chimica farmaceutica e tossicologica II

Chimica farmaceutica e tossicologica

Sistema nervoso

Il sistema nervoso è organizzato in centrale e somatico. Importante è la barriera ematoencefalica. La comunicazione neuronale si realizza per trasmissione degli impulsi in modo:

• Intracellulare: tramite conduzione assonica. Il segnale trasmesso dall’assone verso le sinapsi è generato dall’interpolazione dei vari segnali in entrata a livello centrale e dendritico. Il potenziale a riposo di una membrana cellulare è di 60-100 mV. Raggiunto un determinato potenziale soglia, a livello del monticolo assonico si ha l’apertura rapida e improvvisa di canali ionici permeabili a Na⁺ e K⁺: Na⁺ entrerà nella cellula mentre K⁺ uscirà, in entrambi i casi per gradiente di concentrazione; la depolarizzazione generata dallo scambio ionico verrà quindi trasmessa per tutto l’assone, generando un impulso nervoso. Se l’assone è mielinizzato l’impulso verrà condotto in modo saltatorio (più veloce); in caso contrario, la conduzione verrà definita continua (più lenta).
• Extracellulare: tramite conduzione sinaptica. Il segnale viene trasmesso nel momento in cui il potenziale assonico arriva al terminale sinaptico. Il potenziale d’azione in arrivo induce l’esocitosi di vescicole sinaptiche contenenti NT, i quali, liberati nello spazio sinaptico, andranno a legare i recettori relativi sul terminale postsinaptico. A seconda del tipo di recettore e della cellula interessata, il segnale potrà essere stimolatorio o inibitorio. In generale, si ha quindi la conversione di energia chimica in energia elettrica.

Neurotrasmettitori (NT)

Un NT, per essere definito tale, deve avere determinati requisiti:

• Biosintesi: solitamente a partire da un amminoacido.
• Accumulo: avviene in vescicole apposite.
• Rilascio: avviene in seguito alla segnalazione neuronale e per esocitosi.
• Recettore specifico: solitamente presenti sul terminale sinaptico. Quando interagisce col NT si ha effetto biologico.

In base al tipo di azione, i recettori possono essere classificati in:

• Autocettori: recettori presinaptici che regolano la liberazione del NT che li ha attivati (es. recettori nicotinici che aumentano la liberazione di ACh).
• Eterocettori: recettori presinaptici che regolano il rilascio di un NT diverso da quello che li ha attivati (es. recettori nicotinici presenti su neuroni dopaminergici che, quando attivati, aumentano la liberazione di dopamina).

Il meccanismo di blocco dell’azione avviene per evitare sovraespressioni e sovratrasmissioni. La terminazione può avvenire in vari modi:

• Degradazione enzimatica: enzimi presenti nello spazio sinaptico catabolizzano il NT spegnendo la trasmissione. Esistono due tipi di enzimi:
  • COMT: Catecol-O-Metil Transferasi, trasferisce un metile sull’OH in meta, rispetto alla catena laterale, del catecolo.
  • MAO: MonoAmmino Ossidasi, convertono il terminale amminico in un gruppo aldeidico liberando ammonio. Utilizzano FAD come cofattore.
• Re-uptake: il NT viene reinternalizzato dal terminale presinaptico.
• Diffusione: verso l’esterno dello spazio sinaptico per gradiente.

Neuromodulatori

Se uno di questi requisiti non viene soddisfatto, la molecola prende il nome di neuromodulatore (o neuroregolatore o neurormone); per questi composti non sono tipicamente presenti meccanismi di re-uptake. La dopamina, nonostante sia un NT, ha azione modulatoria su diverse strutture (es. ipofisi); è quindi definibile anche neurormone. Un altro esempio sono le encefaline, pentapeptidi oppioidi composti da una catena di Tyr-Gly-Gly-Phe-X, con X che può essere Met o Leu, che funzionano da neuromodulatori poiché sprovvisti di un meccanismo di re-uptake.

Ricordiamo che la comunicazione intercellulare, oltre che tramite trasmissione sinaptica, si può esplicare anche per segnalazione ormonale, a lunga distanza o a corta distanza (autacoide), dando ad esempio azioni paracrine o autocrine (es. istamina).

Recettore

Un recettore è una struttura che riceve un segnale specifico da un mediatore endogeno, dando risposta cellulare con un’intensità proporzionale alla stimolazione dello stesso. Il ligando del recettore può essere un agonista o un antagonista, competitivo (o sormontabile) o non competitivo (o non sormontabile); nel secondo caso, oltre al legame in un sito diverso dal sito allosterico, questo tipo di antagonisti può legarsi covalentemente al sito attivo.

Il legame tra recettore e ligando può avvenire solo se il ΔG° < 0. Valori ottimali di per un agonista sono ca. 10^-6/-7, mentre per gli antagonisti si aggira attorno a 10^-8/-9 poiché le molecole degli antagonisti sono solitamente più ingombranti e voluminosi rispetto agli agonisti, formando quindi interazioni additive col recettore.

Teoria recettoriale

Per ogni farmaco e recettore che interagiscono è necessario studiare la loro relazione struttura-attività SAR, la quale ci permette di ottenere informazioni su come viene convertita l’interazione chimica nell’attività biologica che ne deriva. Per ottenere le SAR bisogna correlare i parametri che descrivono la struttura della molecola ai parametri farmacologici:

• Parametri strutturali: la cosa più importante è definire il farmacoforo, ovvero la zona della molecola che è necessario sia presente per avere effetto biologico (non per forza tutta la molecola deve interagire con il recettore):
  • Struttura;
  • Stereoisomeria: due molecole enantiomere non hanno necessariamente le stesse proprietà farmacodinamiche, nel caso in cui gli elementi di simmetria facciano parte del farmacoforo. Vengono comprese tutte le tipologie di isomeria (es. cis-trans);
  • Caratteristiche chimico-fisiche: modulabili per ottenere diversi effetti. Si può, ad esempio, modulare la lipofilia della molecola per evitare l’azione del farmaco in determinati distretti o per favorirne altri (es. molecole idrofile non passano la barriera ematoencefalica).
• Parametri farmacologici:
  • Potenza: indica la concentrazione alla quale una molecola riesce a spiazzare l’endogeno, o un altro farmaco, dal sito recettoriale;
  • Efficacia: indica se il farmaco sviluppa attività biologica o meno. Dipende dall’attività intrinseca che ha la molecola e dal tipo di tessuto interessato; per gli agonisti α ≤ 1, mentre per gli antagonisti α = 0;
  • Affinità: indica quanto il farmaco è affine per il sito recettoriale, e quindi quanto il farmaco si lega al proprio recettore. È quantificata dalla costante di dissociazione (1/K_d).

Tutti questi parametri vengono ottenuti tramite:

• Studi in vitro: e, per molecole promettenti, anche studi in vivo. Gli studi dei vari parametri vengono svolti utilizzando la curva dose-risposta, o in scala lineare o in scala semilogaritmica (preferita per valutare ad occhio l’EC₅₀), relativa al farmaco in studio. In generale, per agonisti pieni si ha un aumento graduale della risposta fino ad un massimo corrispondente all’effetto massimo ottenibile, mentre gli agonisti parziali avranno una risposta con effetto massimo minore del 100%; gli antagonisti, al contrario, non daranno nessuna risposta poiché, appunto, bloccano l’attività del recettore. Co-somministrando un agonista (pieno) e un antagonista si possono avere due casi differenti, a seconda che l’antagonista sia:
  • Competitivo: sormontabile, basta aggiungere dosi crescenti di agonista per riottenere l’effetto massimo. L’efficacia rimane uguale ma l’EC₅₀ aumenta (e quindi la potenza diminuisce). Per valutare la bontà di un antagonista si usa quindi il pA₂;
  • Non competitivo: non sormontabile, non si può riottenere l’effetto massimo aggiungendo dosi crescenti di agonista. L’efficacia diminuisce ma la potenza (EC₅₀) rimane la stessa. Per valutare la bontà dell’antagonista si userà il pIC₅₀.

Gli agonisti parziali hanno solitamente, oltre ad efficacia non massima e quindi attività intrinseca minore di 1, potenza minore rispetto agli agonisti pieni; ciò deriva dal fatto che le interazioni all’interno del sito attivo saranno più sfavorevoli. Vediamo quindi i vari parametri ottenibili dalla curva:

• EC₅₀: indica la potenza, e viene valutata considerando il valore di concentrazione alla quale si ha la metà dell’effetto totale;
• EPMR: EquiPotent Molar Ratio, viene utilizzato per mettere a confronto le curve dose-risposta di due molecole agenti sullo stesso sito recettoriale per valutarne la differenza di potenza. Il confronto può essere fatto solo se i due farmaci agiscono sullo stesso sito (curve parallele). EPMR misura la potenza di un agonista (A) rispetto ad un agonista di riferimento (B): EPMR = EC_50,A/EC_50,B. Deduciamo dalla definizione che A sarà più potente di B se EPMR < 1; vale il contrario;
• pA₂: misura la potenza degli antagonisti, ed è il logaritmo negativo della concentrazione di antagonista competitivo che provoca il raddoppiamento della concentrazione di agonista necessaria per raggiungere lo stesso effetto che si ottiene in assenza dell’antagonista;
• pIC₅₀: log inverso della concentrazione di antagonista che inibisce del 50% la risposta massima dell’agonista.

Studi biochimici

Si fanno studi di binding per saturazione, con soli radioligandi, o per spiazzamento, con radioligandi e farmaco in studio. Ci permette di ottenere:

• R_T: o B_max, recettori totali;
• K_i: costante di inibizione. Calcolata a partire dalla K_d del radioligando, indica il grado di spiazzamento indotto dal farmaco in studio.

Correlando tali parametri riesco a comprendere meglio le caratteristiche del sito attivo, dell’attività biologica generata, dei legami formati all’interno del sito attivo e, in generale, della molecola col recettore, e il meccanismo di interazione delle due entità; nel caso del meccanismo, strutture molto simili possono generare meccanismi d’azione totalmente diversi (es. decametonio e D-tubocurarina).

Teorie recettoriali

• Teoria dell’occupazione (Clark): la risposta è bimolecolare ed è governata dalla legge di massa. Inoltre, la risposta è linearmente proporzionale al numero di recettori occupati, e perciò la risposta massima si ottiene quando tutti i recettori sono occupati: R_L/R_T = [L]/([L] + K_d). Quando il rapporto tra i recettori legati e quelli totali è pari a 1, Clark afferma che si avrà l’effetto massimo EC₅₀ = K_d. Nella realtà dei fatti, però, l’EC₅₀ risulta essere minore della K_d, e perciò si avrà metà della risposta totale ancora prima di aver occupato metà dei recettori totali. Introduciamo quindi una nuova funzione, pD₂, definita come il log inverso dell'EC₅₀: più alto è il pD₂, maggiore sarà la potenza del farmaco poiché ne servirà una concentrazione minore a raggiungere metà della potenza massima (e quindi totale);
• Teoria dell'attività intrinseca: la teoria dell’occupazione venne modificata da Ariëns, il quale affermò che l’interazione di un farmaco con il proprio recettore viene scissa in due stadi:
  • Complessazione: dipende dall’attività intrinseca del ligando e dalla sua capacità di dare effetto (agonista pieno o parziale) o di non darlo (antagonista). Dipende dalla K_d;
  • Produzione dell'effetto: una volta complessati farmaco e recettore, il primo potrà essere in grado di apportare modifiche conformazionali al secondo permettendo di generare l’effetto o meno. Dipende dall’attività intrinseca α.

La legge dell’occupazione viene quindi modificata aggiungendo il termine relativo ad α poiché a questo punto l’effetto biologico sarà dato dal prodotto tra l’attività intrinseca e il numero di recettori totali: α · R_L/R_T = [L]/([L] + K_d).

Studiando due curve dose-risposta di un agonista pieno (A) e di uno parziale (B), è possibile calcolare il valore di α come: α = E_max,B/E_max,A. Essendo che A è un agonista pieno il suo effetto massimo sarà 100%, e perciò assumerà solo valori compresi tra 0 e 1 (rispettivamente antagonista e agonista pieno, con agonista parziale per i valori intermedi);

• Recettori di riserva: la teoria occupazionale venne ulteriormente modificata da Stephenson e Furchgott, i quali aggiunsero una relazione tra l’efficacia e lo specifico tessuto interessato: l’interazione farmaco-recettore, infatti, dipende anche dalla responsività di ogni tessuto in funzione delle sue caratteristiche cellulari, dei recettori che esprime e dai sistemi di secondi messaggeri utilizzati. Sapendo che l’effetto massimo si può ottenere anche senza avere tutti i recettori legati, che la risposta di un farmaco non è linearmente proporzionale al numero di recettori occupati, e che più farmaci diversi possono dare lo stesso effetto pur non occupando lo stesso numero di recettori (diversa efficacia), i due scienziati arrivarono a ipotizzare che diversi tessuti possiedono più recettori di quelli richiesti per la risposta massima, e che perciò la determinazione della K_d attraverso l’EC₅₀ non è più corretta. Questi recettori in più vengono detti recettori di riserva, ovvero recettori che permettono di garantire una risposta biologica anche quando una frazione dei recettori è inattivata; ci sono, inoltre, alcuni casi in cui un farmaco antagonista si comporta da antagonista non competitivo in un tessuto ma da antagonista competitivo, a basse concentrazioni, e da non competitivo, a più alte concentrazioni, in un secondo tessuto. I recettori di riserva sono infatti “visibili” solo quando si studiano antagonisti, poiché abbiamo visto che la risposta massima viene sviluppata anche senza che tutti i recettori siano legati. Secondo Stephenson, la risposta del tessuto è una funzione incognita di uno stimolo S: α · E_max = E_S = f(S). Secondo Furchgott, invece: α · E_max = E_S/f(S).

In ogni momento l’effetto che vedo è una funzione dell’attività intrinseca tessuto-ligando. ε indica l’efficacia “generale”, dipendente dal tessuto e dal numero di recettori occupati; α è invece definita come l’efficacia intrinseca, indipendente dal tessuto e costituente un parametro intrinseco del farmaco.

Negli studi in vivo non è sempre possibile ottenere una relazione diretta tra dose ed effetto; vengono valutati sia l’ED₅₀ che la LD₅₀, oltre al loro rapporto indicato come indice terapeutico: IT = LD₅₀/ED₅₀. Più grande è IT, maggiore sarà la sicurezza del farmaco.

Antagonisti

Concentrandosi ora sugli antagonisti, questi possono essere:

• Sormontabili: a loro volta si suddividono in:
  • Competitivi reversibili: competono per il legame al sito ortosterico. Per valutare la potenza di spiazzamento dell'antagonista competitivo si usa il pA₂. Un recettore in presenza di un agonista A e un antagonista B, allo stesso tempo, si troverà coinvolto in 3 equilibri distinti. L’interazione di R con A e B sarà in equilibrio in funzione della concentrazione delle due sostanze. Ogni equilibrio ha una propria costante di dissociazione. Dopo trattazione matematica, arrivo alla conclusione che, in presenza di antagonista, R_T è descritta dall’equazione scritta di seguito: [R] = [R_T][A]/(K_d + [A](1 + [B]/K_b)). A concentrazioni uguali a 0, invece, l’equazione equivale a quella della legge di Clark: [R] = [R_T][A]/(K_d + [A]). Essendo l’antagonista competitivo, per ripristinare la risposta massima basterà aggiungere una quantità ulteriore di A. Questa nuova concentrazione viene indicata con A’, e farà spostare la curva verso destra; l’equazione che la descrive rimane però la stessa, con la unica differenza che dovrà essere indicata la concentrazione di A compresa dell’aggiunta: [A’] = [A][A’]/(K_d + [A](1 + [B]/K_b)). Risolvendo l’equazione rispetto ad [A]: [A’]/[A] = 1 + [B]/K_b. Ponendo e spostando l’1 a sinistra dell’uguale: [A]/[A’] - 1 = [B]/K_blog([A]/[A’] - 1) = log[B] - logK_b. L’equazione ottenuta corrisponde ad una retta. Costruisco quindi un grafico, mettendo in ascissa il log([A]/[A’] - 1) e in ordinata il log[B]. Il termine viene indicato come pA₂, ed è un parametro utilizzato per valutare la bontà di un antagonista competitivo: maggiore è il valore di pA₂, minore sarà la concentrazione di antagonista necessaria a spiazzare l’agonista poiché, appunto, pi