Chimica farmaceutica e tossicologica 2 – Terza parte

CHIMICA FARMACEUTICA II ANTITUMORALI

Il tumore comprende un insieme molto vasto di patologie differenti per eziologia, decorso clinico e

sintomatologia, ma accomunate dall’accumulo di mutazioni (insulti genetici) che compromettono in

modo progressivo i meccanismi di controllo della proliferazione cellulare. La cellula tumorale perde la

capacità di regolare il ciclo cellulare e di attivare i processi di apoptosi quando si manifestano

anomalie. Questa perdita doppia – controllo della replicazione e attivazione dei sistemi di

salvaguardia – permette alla cellula di replicarsi in modo incontrollato e porta alla formazione di

masse cellulari che causano danni sistemici spesso letali. Un’ulteriore caratteristica è la capacità di

metastatizzare, ossia diffondere dal sito primario verso tessuti distanti tramite il sistema linfatico o

sanguigno.

Le strategie terapeutiche antitumorali classiche sono quattro. La chirurgia, quando possibile,

consente l’asportazione diretta della massa tumorale. La radioterapia utilizza radiazioni per

distruggere il tessuto neoplastico. La chemioterapia impiega farmaci che colpiscono le cellule

maligne (e spesso anche quelle non maligne). Più recentemente si sono aggiunti gli inibitori dei

checkpoint immunitari, soprattutto anticorpi monoclonali che riattivano il sistema immunitario

contro le cellule tumorali, superando i meccanismi con cui queste ultime “ingannano” l’immunità e si

fanno riconoscere come cellule normali (il sistema immunitario del paziente riconosce e attacca le

cellule tumorali).

La chemioterapia può essere considerata secondo due grandi approcci. Uno sfrutta la caratteristica

fondamentale delle cellule tumorali, cioè la loro proliferazione incontrollata: colpendo cellule in

rapida replicazione si ottiene un effetto antitumorale, ma allo stesso tempo vengono danneggiate

anche cellule sane fisiologicamente in turnover rapido, come quelle del midollo osseo o del bulbo

pilifero. Da qui derivano effetti collaterali tipici come immunosoppressione, alopecia e nausea.

Nonostante la tossicità, questi farmaci rimangono parte essenziale di molti protocolli terapeutici, sia

da soli sia come terapia adiuvante o neoadiuvante alla chirurgia. 144 / 241

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L’altro approccio cerca di avvicinarsi alla “magic bullet” di Ehrlich, analizzando in dettaglio la biologia

delle cellule tumorali. La presenza di mutazioni accumulate compromette i meccanismi di riparo e

altera interi pathway metabolici, portando alla sovraespressione di specifici recettori, proteine o

enzimi. Questa informazione permette di progettare molecole mirate contro bersagli presenti quasi

esclusivamente nelle cellule tumorali, dando origine alle targeted therapy. Queste terapie cercano di

colpire componenti essenziali della cellula neoplastica minimizzando il danno ai tessuti sani.

Le cellule tumorali, però, essendo instabili e soggette a continue mutazioni, sviluppano facilmente

resistenze ai farmaci. Una singola mutazione può rendere inefficace un intero trattamento. Per questo

molti protocolli prevedono l’uso di combinazioni di più farmaci per ridurre la probabilità che emerga

un clone resistente (cocktail). La prognosi di molte forme tumorali rimane severa e questo rende

accettabili, nel contesto terapeutico, effetti collaterali che non sarebbero tollerati in altre patologie.

Tuttavia, negli ultimi anni alcuni tumori sono diventati curabili e, in altri casi, patologie un tempo

rapidamente letali possono trasformarsi in malattie croniche, come osservato in alcune forme di

melanoma.

Per comprendere i chemioterapici che agiscono sul DNA è

utile richiamare le strutture di nucleosidi e nucleotidi,

distinguendo quelli del DNA e dell’RNA. I nucleotidi sono i

veri substrati utilizzati durante l’allungamento della catena

di DNA. La reazione procede tramite un attacco nucleofilo

del gruppo ossidrilico in posizione 3’ dello zucchero sul

fosforo del nuovo nucleotido trifosfato, con liberazione di

pirofosfato. Si tratta di una reazione di transesterificazione

che permette l’aggiunta del nuovo nucleotide alla catena

nascente, mantenendo l’estremità 3’ disponibile per

l’attacco successivo. %

*I nucleosidi e i nucleotidi sono le unità fondamentali degli acidi nucleici e si distinguono per la

presenza o meno del gruppo fosfato. Un nucleoside è formato da una base azotata legata a uno

zucchero pentoso attraverso un legame Le basi possono essere purine: adenina e

β-glicosidico.

guanina, con struttura biciclica, oppure pirimidine: citosina, timidina e uracile, con struttura

monociclica. Lo zucchero è ribosio negli RNA e desossiribosio negli DNA; la differenza è l’assenza del

gruppo ossidrilico in 2’ nel desossiribosio, fondamentale per la stabilità maggiore del DNA. Il legame

glicosidico unisce l’atomo N1 delle pirimidine o l’N9 delle purine al carbonio 1’ dello zucchero. 145 / 241

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Un nucleotide è un nucleoside che ha aggiunto uno o più gruppi fosfato esterificati al carbonio 5’ del

pentoso. Questa fosforilazione conferisce carica negativa alla molecola e permette ai nucleotidi di

polimerizzare. I nucleotidi trifosfato, come ATP, GTP, CTP e UTP, sono le forme energetiche e attive per

la sintesi: la rottura dei legami fosfoanidridici fornisce energia sia per le reazioni cellulari sia per la

formazione dei legami fosfodiestere negli acidi nucleici. I nucleotidi partecipano al metabolismo

come trasportatori energetici, cofattori (NAD+, FAD, CoA derivano da nucleotidi modificati), secondi

messaggeri come cAMP e cGMP e soprattutto come monomeri per la sintesi di DNA e RNA.*

AGENTI ALCHILANTI

Gli agenti alchilanti (tra le prime classi sviluppate) formano una categoria ampia di farmaci

antitumorali composta da diverse sottoclassi chimiche accomunate dalla capacità di interferire in

modo generalmente aspecifico con il metabolismo del DNA. Il loro meccanismo d’azione consiste

nella formazione di legami covalenti con i nucleosidi durante i processi di replicazione, proofreading e

nelle attività enzimatiche correlate. L’alchilazione del DNA genera una serie di danni strutturali che

compromettono la capacità della cellula di replicare correttamente il materiale genetico. Questa

azione risulta particolarmente efficace nelle cellule che si dividono rapidamente, come quelle

tumorali, ma coinvolge inevitabilmente anche cellule sane ad alta proliferazione, come quelle del

midollo osseo, dell’epidermide e dei bulbi piliferi.

-MOSTARDE AZOTATE 146 / 241

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Tra le sottoclassi più antiche rientrano le mostarde azotate, il cui sviluppo deriva da osservazioni fatte

durante la Prima guerra mondiale. L’iprite, un gas bellico, aveva mostrato una marcata attività

mielosoppressiva, segno della sua capacità di colpire preferenzialmente i tessuti in rapida

replicazione. Da questa osservazione è stato possibile derivare molecole terapeuticamente utili. Le

mostarde azotate presentano una struttura generale caratterizzata da un atomo di azoto sostituito

con un gruppo R, e generalmente da due atomi di cloro; sono spesso molecole simmetriche e questa

simmetria gioca un ruolo chiave nel loro meccanismo d’azione.

La molecola, attraverso un processo di attivazione intramolecolare, genera un gruppo elettrofilo in

grado di reagire tramite sostituzione nucleofila con siti nucleofili presenti sulle basi azotate del DNA

(la molecola si attiva, espone un gruppo elettrofilo che innesca una reazione di sostituzione

nucleofila reagendo con una controparte nucleofila sulla base azotata). La posizione più reattiva è

l’N7 della guanina (sul DNA), con un’elevata preferenza rispetto agli altri siti reattivi, i quali seguono

con una reattività nettamente inferiore (su slide). Poiché le mostarde possiedono due gruppi reattivi

equivalenti (2Cl), possono formare due legami covalenti, dando origine a:

- 2 legami covalenti tra i due filamenti del DNA (legami/crosslink interfilamento), bloccano

fisicamente i due filamenti tra impedendone la separazione durante la replicazione e processi.

- 2 legami covalenti all’interno dello stesso filamento, legami intrafilamento che generano

distorsioni tridimensionali che compromettono la corretta geometria del DNA.

- La reazione sulla base azotata (DNA, in particolare guanina N7 che viene alchilata) può portare

direttamente alla rottura dell’anello imidazolico o la perdita dell’intera base azotata, portando

alla propensione della rottura della catena di DNA.

- L’alchilazione dell’N7 della guanina favorisce e stabilizza la forma tautomerica di enolo (che

solitamente è sfavorita nella guanina). Questo porta alla formazione di un appaiamento NON

Watson e Crick, compromettendo ulteriormente la geometria del DNA.

- L’attività dei gruppi elettrofili non si limitano solo alle basi azotate, qualsiasi buon nucleofilo

può subire l’attacco, compresi residui reattivi come la cisteina (attivata) delle proteine,

causando legami covalenti anche con proteine cellulari. 147 / 241

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L’insieme di queste alterazioni genera un danno estremamente eterogeneo e difficilmente prevedibile

nel dettaglio (ho vari targhet), ma con un risultato complessivo certo: l’impossibilità per la cellula di

replicare il DNA in modo corretto e quindi l’induzione della morte delle cellule che si trovano in fase

attiva di replicazione.

Le mostarde azotate si attivano attraverso un meccanismo intramolecolare molto preciso, reso

possibile dalla loro struttura simmetrica e dalla presenza del doppietto elettronico sull’azoto. Il punto

chiave è la formazione dello ione aziridinio, che rappresenta il vero intermedio elettrofilo responsabile

dell’alchilazione delle basi azotate del DNA (presenta una posizione fortemente elettrofila, che

reagisce con le posizioni nucleofile della base azotata/proteine).

Il processo inizia dal doppietto dell’azoto che attacca intramolecolarmente il carbonio legato al

α

cloro. Il cloro è un buon gruppo uscente e la sua presenza rende il carbonio adiacente

particolarmente suscettibile all’attacco. L’eliminazione del Cl permette la formazione dello ione

aziridinio. Questo intermedio molto reattivo espone un sito elettrofilo in grado di reagire con i gruppi

nucleofili presenti nelle basi azotate del DNA, in particolare l’N7 della guanina, che rappresenta la

posizione più reattiva.

L’attacco nucleofilo porta alla formazione del primo addotto covalente tra il DNA (la base guanina) e il

primo gruppo funzionale della mostarda azotata (formazione del primo legame covalente DNA-

farmaco). Poiché la molecola è simmetrica e possiede due equivalenti, lo stesso processo può

avvenire sull’altro lato, con generazione di un secondo ione aziridinio e instaurazione del secondo

legame covalente. Questo apre la possibilità di formare crosslink sia interfilamento (bloccando i due

filamenti tra loro) sia intrafilamento (alterando la geometria del singolo filamento). Lo stesso

meccanismo si applica anche quando il nucleofilo partner è una proteina, ad esempio tramite residui

di cisteina. Questi eventi si amplificano su tutto il DNA (data la presenza di più molecole di farmaco)

portando a una compromessa capacità della cellula di continuare a replicarsi 148 / 241

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La sequenza di attivazione è quindi definita dal doppietto dell’azoto che promuove l’attacco

intramolecolare, dal cloro che funge da gruppo uscente e dall’anello aziridinico che introduce il sito

elettrofilo responsabile dell’alchilazione. La ripetizione del processo sul gruppo gemello consente la

formazione del doppio legame covalente che compromette in modo irreversibile la capacità della

cellula di replicare il DNA.

La mecloretamina, capostipite delle mostarde azotate, rappresenta il modello più semplice e più

reattivo di questa classe, usato nel linfoma di Hodgkin. Il gruppo R è un metile, fortemente elettron-

donatore: questo aumenta la densità elettronica sull’azoto e rende il suo doppietto molto più

nucleofilo e reattivo. Di conseguenza, la ciclizzazione intramolecolare che porta alla formazione dello

ione aziridinio avviene estremamente rapidamente, conferendo alla molecola un’elevatissima

reattività. È talmente aggressiva che non può essere somministrata per via orale ed è vescicante a

contatto con la pelle, proprietà che ricordano il suo utilizzo originario come agente chimico bellico.

Il tentativo di ottenere derivati più maneggevoli ha portato allo sviluppo del clorambucile, che

mantiene la struttura delle mostarde azotate ma introduce un anello aromatico para-sostituito con

uno spaziatore e un gruppo carbossilico. L’aromaticità stabilizza per risonanza il doppietto dell’azoto,

rallentando la formazione dello ione aziridinio e riducendo radicalmente la reattività. Questo

determina una cinetica più lenta, assimilabile a una pseudo-SN1, molto diversa dal meccanismo

simil SN2 tipico della mecloretamina. Nello sviluppo della molecola si parte dalla mecloretamina, in

cui viene introdotto un anello aromatico per ridurre la reattività del gruppo, ma questo rende il

composto poco solubile; l’aggiunta del gruppo carbossilico in para migliorava la solubilità ma

stabilizzava troppo l’azoto, rendendo la molecola poco reattiva (poca attività). Solo con l’introduzione

di unità metileniche come spaziatori (così da distanziare l’anello aromatico e il gruppo carbossilico) si

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è raggiunto un equilibrio tra solubilità, stabilità e reattività, dando origine al clorambucile, tuttora

utilizzato e somministrabile per via orale (si è dovuto stabilire una certa distanza dello spaziatore

perché ogni unità in più aumenta la lipofilia).

Un altro importante derivato è la ciclofosfamide, che conserva la caratteristica unità bis(2-

cloroetil)amminica ma presenta un gruppo fosfamide come R. A differenza dei derivati classici, è un

profarmaco che subisce inizialmente un metabolismo epatico ossidativo (a livello del gruppo R, porta

aggiunta di un ossidrile che determina la rottura dell’anello) operata da specifici citocromi P450 (fase

I), questo genera un intermedio che sarà soggetto all’attività di fosfatasi/fosforamidasi, enzimi

sovraespressi nelle cellule tumorali, con conseguente rilascio selettivo della mostarda attiva (quindi

la forma attiva viene rilasciata prevalentemente a livello della cellula tumorale). Questo conferisce un

certo grado di selettività tissutale, sfruttando la maggiore attività enzimatica delle cellule

neoplastiche (c’è una base di targhet terapy).

Parallelamente alla formazione dell’agente alchilante, l’attivazione della ciclofosfamide genera

acroleina, metabolita altamente tossico. È il principale limite alla somministrazione del farmaco ed è

un effetto collaterale inevitabile perché intrinseco al meccanismo di attivazione.

La cascata metabolica porta quindi alla liberazione della classica struttura della mostarda azotata,

che forma lo ione aziridinio e instaura legami covalenti bifunzionali con il DNA, analogamente agli altri

composti della stessa classe.

-NITROSOUREE 150 / 241

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Le nitrosouree rappresentano una classe di agenti alchilanti caratterizzati da una particolare

instabilità chimica che ne determina l’attività antitumorale. La prima in cui è stata è stata riscontrata

attività è la metilnitrosourea, una molecola semplice non utilizzata in terapia (poco attiva) ma molto

utile per comprendere il meccanismo. Nel mezzo cellulare la nitrosourea è chimicamente instabile e

va incontro a decomposizione spontanea; da questa degradazione si formano due specie altamente

reattive. Una è lo ione diazonio, in questo caso lo ione metildiazonio, caratterizzato da una carica

positiva e con forte capacità alchilante, in grado di reagire con siti nucleofili delle basi azotate del

DNA, compromettendo la replicazione. L’altra specie liberata è un isocianato, che può a sua volta

interagire congruppi presenti in proteine o basi del DNA, contribuendo alla tossicità e all’effetto

citotossico complessivo.

Tra le molecole terapeutiche di questa classe rientrano carmustina e lomustina, caratterizzate da una

marcata lipofilia che permette loro di attraversare la barriera ematoencefalica. Questa proprietà le

rende particolarmente utili nel trattamento di vari tumori cerebrali, patologie difficili da trattare per la

scarsa accessibilità del SNC ai chemioterapici e agli anticorpi monoclonali. Lo ione diazonio generato

ricorda strutturalmente le mostarde azotate e mantiene la capacità di formare legami covalenti con le

basi azotate, in particolare con l’N7 della guanina. Rispetto alle prime nitrosouree, la progettazione di

nuovi derivati ha permesso di ottenere molecole in grado di generare due addotti covalenti,

aumentando la probabilità di crosslinking del DNA e potenziando l’attività citotossica. Gli effetti

collaterali sono gravi, ma considerati accettabili per l’indicazione oncologica a cui sono destinati

-TRIAZENI 151 / 241

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I triazeni costituiscono un ulteriore gruppo di agenti alchilanti con utilizzo rilevante nei tumori

cerebrali. Queste molecole richiedono attivazione metabolica e convergono nella generazione della

stessa specie elettrofila (agente alchilante), cioè lo ione metildiazonio. Le molecole son caratterizzate

da una struttura triazenica, ed è essenziale che almeno uno dei sostituenti R’ e R” (idealmente

entrambi) sia un gruppo metile.

Il primo passaggio è operato dai citocromi della fase I,