Chimica analitica strumentale applicata

Elettroforesi capillare

L'elettroforesi è il movimento di particelle cariche mosse da un campo elettrico, che si muovono in un fluido che ha una viscosità non nulla. Per effetto del campo elettrico applicato ci sarà una separazione delle specie cariche, la velocità con cui avviene la migrazione dipende dalla carica e dalla massa della particella stessa. Sono state sviluppate diverse tecniche separative basate su questa tecnica che si possono raggruppare in 2 famiglie: elettroforesi su supporto (GE, supporto gel) ed elettroforesi capillare o in fase libera (il liquido non ha altri ostacoli se non il contenitore).

Il principio della separazione si basa sulla differenza di velocità dei soluti carichi in un campo elettrico: v = μe (mobilità elettroforetica) *E. μe è proporzionale alla forza elettrica (FE) e indirettamente proporzionale alla forza frizionale FF (dovuta a 2 fattori: attrito e moto dei contro ioni / effetto di trascinamento). FF dipende dalla viscosità η della soluzione, dal raggio della particella e dalla velocità stessa della particella.

Inizialmente la particella è immobile, quando viene applicato il campo elettrico la particella si muove fino a raggiungere una velocità limite dove la forza elettrica e la forza di ritardo (o forza frizionale) si eguagliano, da qui si ricava la definizione di μe che dipenderà dalla carica della particella, dal raggio (relazionata alla massa della particella) e dalla viscosità del mezzo in cui si muove. La mobilità elettroforetica della molecola carica dipende dall'analita e dal rapporto carica/raggio, il valore di questa costante fisica è un valore teorico, che permette di capire quali sono i fattori determinanti della velocità della particella nel sistema (ma non tiene conto di altri fattori).

Storia e sviluppo

Il primo esperimento di questa tecnica è stato fatto negli anni '30, un esperimento molto semplice, ma con separazione delle particelle non molto efficiente a causa del fatto che le particelle si muovono anche attraverso la diffusione e i moti convettivi → si iniziò a fare l'elettroforesi su supporto. In questa tecnica si pone sul supporto la soluzione da separare, applicando il campo elettrico le particelle con carica negativa migrano verso l'anodo e le particelle cariche positive migrano verso il catodo. Il vantaggio di usare un supporto è che si annullano i moti convettivi. L'elettroforesi su gel predilige il sequenziamento del DNA.

Le applicazioni dell'elettroforesi su supporto riguardano specie ad elevata massa molecolare, come i polimeri (biologica e non biologica), mentre in elettroforesi capillare si separano anche specie a bassa massa molecolare (enantiomeri) e macromolecole.

Elettroforesi su gel

È una tecnica molto manuale; si crea il gel sul momento, si applica il campione ad una delle estremità del gel, si immerge nella soluzione elettrolitica e si applica il campo elettrico. Le specie migrano fino ad un punto in funzione della loro mobilità elettroforetica; una volta separate si devono rivelare le bande → procedimento successivo.

La rivelazione può avvenire attraverso l'aggiunta di specie che riescono a reagire con gli analiti presenti evidenziando le bande che si sono formate con proprietà ottiche (coloranti); oppure si possono usare reagenti che reagiscono selettivamente con alcune componenti; un'altra possibilità di rivelazione è la spettrometria di massa nella configurazione MALDI-TOF.

L'elettroforesi su gel si può fare in diversi modi: in formato orizzontale o in formato verticale, in formato blotting (Southern, northern…) che è un trasferimento di specie cariche da un supporto ad un altro (non è proprio una separazione elettroforetica, ma la sfrutta: le componenti sono trasferite su un secondo supporto, che ha caratteristiche tali da adsorbire le specie separate impedendo un successivo loro passaggio in soluzione durante la fase di rivelazione).

• Elettroforesi ad alto voltaggio
• Isoelettrofocalizzazione
• Elettroforesi bidimensionale
• Immunoforesi (fa riferimento al fatto che in combinazione alla separazione si possono usare sistemi di rivelazione specifici)

Elettroforesi capillare

Come supporti si possono usare diversi materiali, normalmente si usa l'acetato di cellulosa (ha una buona resistenza meccanica e un'agevole diafanizzazione → dopo la separazione il supporto viene reso meno bianco per permettere di evidenziare il colore delle bande separate); ma si usa anche il gel di agarosio (che permette anche la diffusione, quindi si possono aggiungere delle sonde specifiche nel gel stesso), o il gel di amido (ha dei pori di dimensioni tali da poter essere usato anche come setaccio molecolare → separazione dimensionale) e il gel di poliacrilammide (il polimero risulta più o meno reticolato in base alla percentuale di bis-acrilammide).

Negli anni '80 si è tornati al modello in fase liquida usando capillari di silice fusa di dimensioni tali da eliminare i moti convettivi (perché la regione in cui si muovono le particelle è micrometrica). Minore è il diametro del capillare, migliore è l'efficienza della separazione → miniaturizzazione del sistema. I campi elettrici che si applicano sono molto intensi, con correnti generate basse (la silice ha un'elevata resistenza elettrica); si realizza in capillari di silice fusa con piccolo diametro interno (ID 25÷100 mm) e lunghezza limitata (20-70 cm). Il volume analizzato è di pochi nL.

Esistono delle tecniche ibride che combinano la migrazione elettroforetica con meccanismi di ripartizione. In elettroforesi capillare si aggiunge la migrazione elettrosmotica; la silice che rappresenta la superficie del capillare presenta dei gruppi silanolici che hanno un comportamento acido → a pH > 4 si presentano in forma dissociata, cioè la superficie assume una carica netta negativa; per questo motivo le cariche positive vengono attirate verso la superficie interna del capillare → si forma un doppio strato (i cationi del secondo strato sono solo debolmente legati). Applicando il campo elettrico le cariche positive si muovono verso il catodo e poiché i cationi sono solvatati vengono trascinate anche le particelle di solvente → si crea un moto, che è il flusso elettrosmotico (EOF).

La velocità con cui si muove il liquido all'interno del capitare per effetto del flusso elettrosmotico è (quasi) uniforme lungo la sezione del capillare (maggiore efficienza, picco più stretto). La velocità del flusso elettrosmotico dipende dal campo elettrico applicato, la costante di proporzionalità è la mobilità elettrosmotica μEOF (che dipende dalla costante dielettrica, dal potenziale e dalla viscosità del mezzo). La mobilità elettrosmotica non dipende, quindi, dalle caratteristiche dei singoli analiti e viene favorita da un aumento della quantità di carica presente alla superficie del capillare (e quindi di z) e da una diminuzione della viscosità del mezzo. Definito quindi un mezzo, la mobilità elettrosmotica, quindi la velocità delle particelle, è uguale per tutte; questa velocità si addiziona alla velocità elettroforetica per dare la velocità totale.

La mobilità totale o apparente è definita da μa = μe + μEOF. Fissate tutte le condizioni strumentali, il tempo di migrazione sarà caratteristico di una particolare specie, come quello di ritenzione in cromatografia. Il tempo di migrazione dipende dalla mobilità della specie (dal rapporto carica/massa).

A differenza della cromatografia liquida dove la spinta della fase mobile è dovuta all'applicazione di una pressione (la forza è maggiore al centro della colonna dove sta avvenendo la separazione mentre ai bordi la velocità è minore → profilo parabolico del flusso), il flusso nell'elettroforesi capillare è inverso: la forza è maggiore vicino alle pareti del capillare. Di conseguenza tutte le particelle si muovono alla stessa velocità → la banda è molto focalizzata. In questo caso l'efficienza della separazione è maggiore rispetto alla cromatografia liquida ad elevata pressione.

Il flusso elettrosmotico ad un pH fissato ha direzione catodica; i cationi si muovono con una velocità maggiore (somma delle due velocità), mentre le specie neutre (che non si muoverebbero in assenza di flusso elettrosmotico) si muovono a velocità del flusso elettrosmotico; gli anioni avranno una velocità che viene sommata alla velocità del flusso elettrosmotico (quindi possono essere trasportati verso il catodo, oppure la loro velocità avrà una dipendenza inversa dal rapporto carica/massa → invertire la posizione dell'anodo e del catodo).

Fattori che influenzano il flusso elettrosmotico

• Campo elettrico applicato (E). Più è elevato il campo, maggiore è la velocità del flusso EOF, quando il campo elettrico viene aumentato troppo si può avere un riscaldamento per effetto Joule.
• Soluzione di elettrolita: pH (più si lavora in campo basico, maggiore è la dissociazione dei gruppi silanolici → maggiore è il flusso EOF; bisogna fare attenzione al pH perché le specie cariche sono pH dipendenti quindi si potrebbe annullare o modificare la carica della particella), forza ionica (aumentando I diminuisce EOF, ma aumentano eccessivamente la concentrazione degli elettroliti il passaggio di corrente è maggiore si ha di nuovo l'effetto Joule, ma lavorando a I basse il campione può essere adsorbito. In generale la forza ionica deve essere simile a quella in cui avviene la separazione).
• Temperatura (i capillari vengono termostatati per evitare l'effetto Joule; inoltre la viscosità del mezzo dipende dalla T bisogna controllare e agire in un sistema termostatato).
• Presenza di modificatori organici (attenzione che può modificare la selettività del sistema).
• Aggiunta di tensioattivi (interazione elettrostatica) o polimeri neutri o carichi che interagiscono con la silice andando a schermare la carica superficiale (ridurre la carica superficiale).
• Modificare covalentemente la superficie, cioè legare i gruppi silanolici con gruppi diversi che rendono il capillare neutro, oppure modificare l'idrofilicità.

Efficienza e risoluzione

La capacità separativa fa riferimento alla risoluzione, cioè la capacità di separare due ioni tra loro → concetto legato all'efficienza (larghezza del picco in analogia alla trattazione della cromatografia). L'efficienza può essere espressa come numero di piatti teorico, o come altezza del piatto teorico (secondo la trattazione classica della cromatografia).

Nel caso dell'elettroforesi la separazione in fase libera, non ci sono equilibri di ripartizione tra la fase stazionaria e la fase mobile → dall'equazione si possono eliminare i termini. L'espressione si semplifica molto, e dipende solo dal termine B (che fa riferimento alla diffusione); dato che la diffusione può essere radiale o longitudinale, ma quella radiale può essere non considerata, ovviamente rimane la dipendenza dalla velocità del flusso. La varianza totale del picco in questa tecnica, A cui sono aggiunti dei contributi che allargano la banda, ma possono essere controllati con la strumentazione. La varianza dovuta alla diffusione può essere definita come La lunghezza totale del capillare è la lunghezza fisica del capillare (L), la lunghezza in cui avviene la separazione è minore (l): corrisponde alla lunghezza dalla posizione di deposizione del campione fino al punto dove avviene la rivelazione (di solito messa vicino al catodo, ma prima).

Il contributo all'efficienza dovuto alla diffusione longitudinale è dovuto a parametri geometrici dello strumento e da parametri specifici dello ione. Parlando di risoluzione, essa dipende dalla larghezza delle bande di ciascuno dei due ioni separati, ma anche dalla differenza dei due massimi (cioè la differenza di tempo di ritenzione dei due ioni). L'espressione matematica della risoluzione elettroforetica è Il rapporto tra le due mobilità elettroforetiche μa/μb = α, cioè la selettività elettroforetica.

Quando si lavora con flussi osmotici intensi, il contributo della mobilità elettroforetica delle singole specie influenza poco la mobilità totale → la selettività diminuisce, per questo motivo si deve trovare un modo per diminuire il flusso elettrosmotico.

Oltre alla diffusione longitudinale ci sono altri fattori che contribuiscono ad allargare il picco: riscaldamento Joule (maggiore è la velocità del flusso, maggiore è l'efficienza → se si aumenta il potenziale per aumentare la velocità si rischia di arrivare al riscaldamento Joule, che porta a sua volta gradienti di temperatura) lunghezza iniezione, adsorbimento del campione, fenomeno della elettrodispersione (differenza di conducibilità tra campione e campione di corsa), dislivello tra contenitori tampone e dimensioni della cella del rivelatore (deve essere piccola in relazione alla banda del picco).

• Il coefficiente di diffusione longitudinale dipende molto dalla specie in considerazione, è il valore che modifica la diffusione della specie e quindi anche la larghezza della banda. Questo valore diminuisce all'aumentare della massa della specie → questa tecnica ha una buona selettività per le molecole a massa maggiore.
• L'effetto Joule può essere controllato; è il riscaldamento che si osserva per passaggio di corrente (i capillari vengono termostatati per controllare questo effetto).
• Volte del campione iniettato, viene chiamata lunghezza di iniezione. Più campione viene inserito minore è l'efficienza (la banda si allarga di più); questo contributo può essere espresso con (equazione riportata sulle slide). Per diminuire l'allargamento della banda si controllano le condizioni sperimentali in modo che tutti i contributi che allargano la banda non modifichino il valore più del 10% → trovare il compromesso che dipende dalla situazione.
• Interazione dell'analita con le pareti del capillare, nel sistema ideale le pareti interagiscono solo con gli elettroliti, ma non con l'analita → dato che le particelle da separare sono spesso cariche possono essere adsorbite delle pareti. L'interazione può essere così significativa che l'analita non esca dal capillare e quindi non può essere rivelato (blocco del capillare). In questo caso risulta utile schermare la superficie del capillare, con l'introduzione di una specie che scherma la superficie e limita i fenomeni di adsorbimento.
• Elettrodispersione, si genera quando la conducibilità del campione è diversa da quella del mezzo in cui avviene la separazione (tipicamente un tampone, in generale un solvente in cui sono presenti delle specie cariche). La distorsione del picco può essere di due tipi: fronting (il campione ha una conducibilità più elevata di quella del tampone) o tailing (la conducibilità del tampone è maggiore rispetto a quella del campione). Nel caso del fronting il campo elettrico all'interno della banda del campione è inferiore rispetto a quello del tampone → mentre il campione migra gli ioni che diffondono in avanti troveranno un campo elettrico più forte che accelera il loro moto, si genera un picco con un fronte asimmetrico; stessa cosa ma opposta nel caso del tailing. Il fenomeno è dovuto alla differenza di intensità del campo elettrico, questo fenomeno si aggiunge alla diffusione longitudinale degli ioni.
• Il pH influisce sulla separabilità (non sull'efficienza), dato che il pH regola il flusso elettrosmotico, esso influenza la mobilità elettrosmotica e quindi la velocità apparente delle specie del sistema → questo si riflette sulla separabilità del sistema. Inoltre il pH influenza la forma chimica con cui le specie si trovano (si modifica lo stato di carica della specie) → si modifica la mobilità elettroforetica della specie. Per diminuire questi effetti si scherma la superficie del capillare.

Il mezzo a cui avviene la separazione deve avere una concentrazione sufficientemente elevata ed equilibrata con quella del campione (evitare diffusione e elettrodispersione), deve permettere di controllare il pH (solitamente sono tamponi ad elevata concentrazione), e non deve generare un segnale significativo che potrebbe nascondere le specie di interesse (assorbimenti in radiazione UV-vis oppure di fluorescenza), gli elettroliti che costituiscono la soluzione non devono essere adsorbiti alla parete del capillare; se si riesce ad averli anche a basso costo ed elevata disponibilità sarebbe top. Il capillare è solitamente ricoperto di uno strato di poliammide, è inserito alle estremità nel tampone, uno è l'anodo e l'altro è il catodo. Quando avviene l'esperimento un'estremità viene immersa nella soluzione che contiene l'analita, e dopo il tempo necessario la si reinserisce nel tampone e si mette il potenziale. Al termine della separazione l'estremità del capillare nella soluzione anodica viene lavata, mentre quella catodica viene svuotata (per ripristinare il capillare alle condizioni iniziali e il capillare possa essere riutilizzato). Le operazioni di spostamento delle estremità sono automatizzate, inoltre si ha un sistema per la pressurizzazione del sistema. L'iniezione del campione può avvenire secondo vari metodi.