Biotecnologie farmacologiche

Biotecnologie farmacologiche

Definizione e storia delle biotecnologie

Le biotecnologie sono delle applicazioni tecnologiche che utilizzano sistemi biologici, organismi o parti di essi per modificare o produrre prodotti o processi destinati a un impiego specifico. A lungo l’uomo ha utilizzato le fermentazioni per la produzione di bevande (vino e birra) e alimenti (formaggi e yogurt), sfruttando organismi come batteri e lieviti senza servirsi delle tecniche del DNA ricombinante. A fronte di queste biotecnologie tradizionali, oggi si può contare sulle cosiddette biotecnologie innovative, le quali si basano sulle tecniche del DNA ricombinante con la possibilità di isolare e clonare o, in generale, manipolare una sequenza del DNA per poi inserirla in un ospite eterologo per un nostro scopo o necessità.

La nascita delle biotecnologie farmacologiche è strettamente correlata con la scoperta delle tecniche del DNA ricombinante grazie a cui si possono modificare organismi o parte di questi, aprendo le porte alla possibilità di sfruttare queste tecnologie a scopo farmacologico per la salute dell’uomo.

Una serie di rilevanti scoperte ha anticipato l’avvento del DNA ricombinante. Il ricercatore Paul Berg si era trasferito all’Università di Stanford verso la fine degli anni ’50 del secolo scorso, ma precedentemente aveva trascorso del tempo nel laboratorio di Renato Dulbecco, dove aveva appreso le tecniche di colture cellulari ed era entrato in contatto con alcune sue scoperte. Dulbecco, infatti, aveva capito che alcune cellule cancerose avevano assunto questo stato a seguito della trasformazione da parte di alcuni virus. Il materiale genetico di questi virus doveva dunque essere responsabile della trasformazione neoplastica delle cellule cancerose.

Si ipotizzò che dovesse verificarsi un trasferimento del materiale genetico dal virus alla cellula o comunque che la cellula fosse in grado di utilizzare il DNA virale stesso. Partendo da questa osservazione, Berg e altri ricercatori si chiesero se i virus non potessero essere utilizzati come vettori per trasferire il materiale genetico alle cellule. Il problema principale che dovettero affrontare consisteva nel fatto che i virus conosciuti fino a quel momento (come SV40 e Polyomavirus) erano molto piccoli, perciò non sarebbero stati in grado di ospitare lunghe sequenze al loro interno. Pensarono allora di combinare il genoma virale di SV40 con un DNA plasmidico isolato dal batterio E. coli, il che fu possibile grazie alla scoperta delle estremità coesive. All’epoca si stavano ancora caratterizzando gli enzimi di restrizione, per cui queste estremità coesive furono realizzate con l’aggiunta di nucleotidi: dopo diverse difficoltà tecniche, si poté creare la prima molecola di DNA ricombinante tramite una procedura che venne pubblicata nel 1972.

Successivamente ai ricercatori Stanley Cohen (Università di Stanford) e Herbert Boyer (UCSF) venne l’idea di inserire il DNA ricombinante all’interno di un organismo vivente quale il batterio, permettendo così la naturale replicazione del DNA. Nel dettaglio, era Cohen a occuparsi di isolare i plasmidi, consegnandoli in seguito a Boyer che, nel suo dedicarsi agli enzimi di restrizione, era arrivato a scoprire proprio EcoRI. Una volta che il DNA era stato digerito, fu riportato a Cohen, il quale procedeva con la reazione di ligazione e l’inserimento nel batterio; così facendo, i plasmidi venivano purificati e analizzati in entrambi i laboratori. La riuscita di questo esperimento fu dovuta alla possibilità di utilizzare enzimi di restrizione come EcoRI, formando così delle estremità coesive compatibili.

A seguito di questi primi esperimenti, i ricercatori divennero sempre più abili nel manipolare molecole di DNA ricombinante, perciò proseguirono inserendo dei geni per la resistenza ad antibiotici come kanamicina e tetraciclina. Scoprirono addirittura che il materiale genetico poteva essere scambiato anche tra specie differenti: si aprì la possibilità di sfruttare queste tecniche per la cura dell’uomo, magari inserendo nel batterio sequenze codificanti per proteine di origine umana, vale a dire di interesse terapeutico.

Nascita dell’industria biotecnologica

I primi a realizzare le potenzialità di queste tecnologie furono lo stesso Boyer e Robert Swanson, che nel 1976 fondarono la Genentech, prima azienda di biotecnologie farmacologiche. La prima proteina umana espressa nei batteri fu la somatostatina, ad opera di Boyer in collaborazione con il ricercatore Keiichi Itacura. Tuttavia, la trovata più importante fu il clonaggio e l’inserimento in un batterio dell’insulina umana, usata per curare il diabete di tipo 1. Prima di questa intuizione, risalente al 1978, l’insulina somministrata alle persone diabetiche veniva estratta dal pancreas di suini e bovini, il che rappresentava un grave problema per i pazienti: innanzitutto c’era scarsa disponibilità di insulina (diversamente occorreva sacrificare un elevato numero di animali), in più l’insulina animale non era così pura (non si disponeva ancora di avanzate tecniche analitiche di purificazione), infine le preparazioni non erano uniformi (ogni volta l’effetto poteva essere differente). I soggetti diabetici devono controllare molto accuratamente i livelli di glicemia, essendo condizioni pericolose sia l’iperglicemia che l’ipoglicemia: considerate queste problematiche nel loro insieme, la scoperta e la possibilità di produrre l’insulina per via ricombinante hanno costituito un’importante rivoluzione.

A seguito del clonaggio e dell’espressione dell’insulina all’interno di E. coli, la Genentech e l’azienda farmaceutica Eli Lilly svilupparono il processo per la produzione dell’insulina ricombinante umana (Humulin), che fu approvata per l’uso nell’uomo nel 1982, tant’è vero che al momento tutta l’insulina somministrata è prodotta mediante biotecnologie farmacologiche.

Nella storia di queste tecnologie, il passo successivo fu il clonaggio e l’espressione del fattore di crescita umano, necessario per il trattamento del deficit della crescita. In un primo tempo questo doveva essere estratto e purificato dal cervello dei cadaveri: anche qui la scarsa disponibilità costituiva un grande problema, pertanto la possibilità di produrlo con DNA ricombinanti fu una vera rivoluzione per i pazienti affetti. Questo fattore fu clonato e inserito nei batteri da Peter Seeburg, che stava lavorando all’UCSF nel gruppo del dottor Goodman.

Quando Seeburg clonò la sequenza dei fattori di crescita, vi inserì anche sequenze aggiuntive al 3’ presenti nel genoma comune ma non necessarie per l’espressione della proteina; questa sequenza fu brevettata essendo ritenuta una scoperta rivoluzionaria. In un secondo momento, Swanson chiese a Seeburg di unirsi al team della Genentech, perché voleva attuare il processo produttivo delle molecole della crescita: Seeburg lasciò l’Università della California accettando l’offerta della Genentech; a questo punto richiese a Goodman e all’UCSF il plasmide in cui aveva precedentemente clonato il fattore della crescita ma, trovandosi questo sotto brevetto, non lo poté ottenere. Date le circostanze, alla Genentech pensarono di ripartire e fare tutto il lavoro dall’inizio, ma la sequenza che Seeburg aveva clonato alla Genentech non funzionava: la leggenda narra che la notte di Capodanno, consapevole che non avrebbe incontrato nessuno, Seeburg tornò nel suo laboratorio in California per recuperare i suoi vecchi plasmidi. Di ritorno al Genentech, il processo produttivo per l’ormone della crescita fu avviato con il plasmide sotto brevetto dell’UCSF, che quindi fece causa alla Genentech stessa. In questa vicenda giocarono un ruolo fondamentale quei 48 nucleotidi aggiunti per sbaglio, in quanto facevano capire che i plasmidi impiegati effettivamente erano gli originali rubati all’UCSF.

Al di là dell’aneddoto, questo episodio dimostra chiaramente l’importanza e la rivoluzione che le tecniche del DNA ricombinante permettono di applicare anche in campo farmacologico.

Interazioni farmaco-recettore

Perché un certo farmaco ha un determinato effetto nel nostro organismo? Perché un antibiotico agisce solo sui batteri? Perché un antitumorale agisce solo sulle cellule tumorali e non su quelle sane? Un farmaco è una molecola di varia natura, come una molecola chimica, una proteina ricombinante, un anticorpo ecc.; quindi, in senso lato, è una molecola che va a interagire con delle specifiche componenti all’interno dell’organismo, che si chiamano recettori. A seguito del legame con il recettore si ha l’effetto, ossia una risposta, un segnale, e delle modificazioni a livello dell’organismo stesso.

Un recettore, in senso lato, è una macromolecola che è in grado di legare un determinato farmaco e in seguito media l’effetto del farmaco stesso; ad esempio, i farmaci antibiotici legano i recettori della cellula batterica, non presenti a livello della cellula umana, e per questo hanno effetto esclusivamente solo sulle cellule batteriche. Allo stesso modo un farmaco antitumorale ha un bersaglio espresso solo sulla cellula tumorale e andrà ad interagire solo con queste.

Perché un farmaco lega un determinato recettore? L’interazione tra farmaco e recettore dipende dalla struttura e dalle caratteristiche chimiche di entrambi. Nel nostro organismo la maggior parte dei recettori sono proteine.

Le proteine

Le proteine sono caratterizzate da una struttura primaria data dalla sequenza amminoacidica, geneticamente determinata; le proteine vengono sintetizzate dal ribosoma e gli amminoacidi tra loro vicini cominciano a stabilire delle interazioni formando delle strutture peculiari come alfa eliche e foglietti beta: queste costituiscono le strutture secondarie delle proteine. Si instaurano anche interazioni tra gli amminoacidi lontani che determinano la struttura terziaria. Se più subunità o più parti della proteina si assemblano in dimeri o altri complessi si otterrà una struttura quaternaria.

Oltre alle interazioni tra amminoacidi anche le caratteristiche di idrofobicità e idrofilia della proteina contribuiscono a formare la struttura della proteina stessa. Le parti idrofobiche sono rivolte all’interno della proteina stessa. Tutte queste caratteristiche contribuiscono a creare la struttura idonea per formare interazioni col farmaco, il quale riconosce e si lega al recettore nel sito di legame: si potrebbe trattare del sito attivo di un enzima o della porzione extracellulare di un recettore di membrana.

Tra il farmaco ed il recettore, nel sito di legame, possono instaurarsi diverse interazioni; in ordine crescente di forza di legame si hanno:

• Le forze di Van der Waals, che sono modifiche transitorie;
• Legame a idrogeno;
• Legame ionico, che rappresenta le interazioni tra ioni di carica opposta;
• Legame covalente (come i ponti disolfuro), è pressoché irreversibile; quindi, un farmaco che si lega con questo tipo di legame al recettore ha una forte azione irreversibile, è il caso dell’aspirina che acetila il proprio recettore (enzima ciclossigenasi) con effetto inibitorio. In questo caso la cellula deve quindi produrre nuovamente l’enzima in questione per possederne una forma funzionale.

Anche l’effetto idrofobico dà informazioni sulle interazioni tra il farmaco ed il recettore: sarà quindi favorito l’instaurarsi di un’interazione tra un recettore ed un farmaco entrambi idrofobici. Il legame a idrogeno e l’effetto idrofobico sono molto importanti nelle prime interazioni tra farmaco e recettore perché hanno una grande ampiezza: si instaurano infatti a diametro maggiore di distanza.

Anche la stereochimica del farmaco è importante: il Warfarin è il principio attivo del Coumadin, farmaco anticoagulante; il suo enantiomero S è 4 volte più potente dell’enantiomero R, quindi una conformazione S interagisce meglio con il recettore bersaglio.

Nella parte sinistra dell’immagine a fianco, in grigio c’è la chinasi BCR-ABL che si viene a formare nelle cellule di leucemia mieloide cronica; questa chinasi non esiste nelle cellule normali. Il farmaco, rappresentato dai pallini blu, è l’Imatinib ed è un inibitore di questa chinasi. Nella parte destra le interazioni che Imatinib instaura con gli amminoacidi dell’enzima sono rappresentate dalle linee tratteggiate (legami a H) e le “coroncine” sono legami ionici. Non c’è quasi mai una sola iterazione tra farmaco e recettore, ma l’insieme delle interazioni tra essi definisce la specificità del legame, quindi il perché un farmaco leghi un determinato recettore.

L’affinità dice quanto bene il farmaco lega il proprio recettore: più è alta e tanto meglio il farmaco si lega; quindi, probabilmente, si può usare una minor quantità di farmaco, generando quindi meno effetti collaterali, avendo lo stesso buona specificità.

A seguito del legame con un recettore come è possibile avere un determinato effetto nell’organismo? Oltre all’esempio visto prima per l’aspirina, un farmaco, a seguito del legame, può indurre una serie di modificazioni conformazionali nel recettore, quindi provoca un adattamento indotto; molti dei farmaci impiegati sui recettori di membrana si legano alla parte extracellulare di questi, ne inducono una modificazione conformazionale che innesca un segnale nella cellula che poi verrà trasdotto.

La struttura del recettore è importante per la sua funzione e per la sua localizzazione nell’organismo. Il farmaco deve raggiungere il recettore, e questo può essere una proteina di membrana oppure un fattore di trascrizione posto nel citoplasma o nel nucleo; quindi il farmaco avrà delle caratteristiche in linea con quelle del recettore: un farmaco lipofilo sarà in grado di attraversare la membrana cellulare e interagire con un recettore presente all’interno della cellula; invece gli anticorpi monoclonali, che sono di grandi dimensioni, difficilmente entreranno nella cellula, quindi raggiungeranno facilmente una proteina extracellulare o un recettore posto sulla membrana.

Un farmaco ideale lega solo il suo recettore bersaglio ed esplica il suo effetto terapeutico solo sul bersaglio; ma il farmaco ideale non esiste, tutti i farmaci interagiscono con varie molecole dell’organismo, e le interazioni con recettori diversi dal bersaglio danno luogo a effetti collaterali.

Strategie per migliorare la selettività di un farmaco

Ci sono due strategie per migliorare la selettività di un farmaco:

• Identificare un recettore bersaglio espresso solo nella determinata tipologia cellulare che si vuole colpire: se il bersaglio è presente solo sul batterio allora il farmaco non colpirà e non ucciderà le cellule umane. Imatinib è un inibitore della chinasi che si forma per traslocazione cromosomica solo nelle cellule di leucemia mieloide cronica, non esistente nelle cellule normali, quindi il bersaglio è espresso solo nelle cellule tumorali. Alcuni chemioterapici hanno molti effetti collaterali poiché il loro bersaglio è presente in molte cellule, come il DNA; altre volte è specifico perché è un recettore espresso solo nelle cellule tumorali, e spesso nelle cellule solo di un determinato tumore. Quindi tanto più la distribuzione del recettore è localizzata in un determinato tipo cellulare e più alta sarà la selettività.
• Selezionare adeguatamente l’accoppiamento tra recettore e sistema di trasduzione del segnale. Ad esempio, i canali del calcio sono espressi in tutte le cellule cardiache, ma sono fondamentali per il funzionamento delle cellule pacemaker, che governano il ritmo del battito cardiaco; invece, nelle cellule muscolari cardiache hanno un ruolo predominante quelli del sodio; quindi, se si colpiscono quelli del calcio si agisce selettivamente sulle cellule pacemaker. Questo perché a livello di trasduzione del segnale ci sono differenze nelle varie tipologie cellulari, quindi se il recettore bersaglio si accoppia in maniera differente con diversi sistemi di traduzione del segnale, in cellule diverse si avrà una diversa selettività del farmaco.

Recettori

Ne esistono sei classi:

• Canali ionici;
• Recettori accoppiati a proteine G;
• Recettori con attività enzimatica;
• Recettori intracellulari;
• Bersagli extracellulari;
• Recettori che mediano l’adesione cellulare.

Canali ionici

Sono complessi multiproteici multisubunità che attraversano la membrana cellulare e consentono il passaggio di ioni; possono essere regolati in modo differente. Svolgono importanti funzioni, ad esempio nella trasmissione nervosa, nella contrazione muscolare, a livello cardiaco e nella secrezione, quindi sono bersaglio di molti farmaci proprio perché sono coinvolti in importanti processi fisiologici.

A seconda di come vengono regolati si possono dividere in tre classi:

• Canali regolati dal ligando, che lega la porzione extracellulare del recettore e ne determina l’apertura;
• Canali regolati dal voltaggio, ossia l’apertura del canale dipende dalla differenza di potenziale a livello della membrana, per esempio a livello neuronale il potenziale d’azione scatena depolarizzazione che fa aprire o chiudere certi canali;
• Canali regolati da un secondo messaggero, quindi attraverso l’attivazione di un recettore, come per esempio potrebbe essere un recettore associato alle proteine G, quando il recettore viene attivato produce un secondo messaggero che va ad attivare il canale ionico;

Per quanto riguarda la struttura, la porzione extracellulare è di grandi dimensioni e i canali possiedono una forma a imbuto, in modo tale da poter controllare il flusso di ioni nel canale. La porzione intramembranaria (quella centrale) è quella che filtra e seleziona gli ioni sulla base della carica e delle dimensioni.