Biologia molecolare eucariotica

Biologia molecolare eucariotica

Introduzione generale

Meccanismi e regolazione dell’espressione genica negli eucarioti

Nel 1958 Crick definì per la prima volta l’idea che il gene portasse alla produzione di una proteina attraverso la produzione di un RNA, che ad oggi sappiamo essere un mRNA. Al tempo, tuttavia, il dogma centrale non era ben definito poiché non era chiaro il meccanismo attraverso il quale un gene riusciva a condurre alla produzione di una proteina. Si era tuttavia capito che molecole proteiche come i ribosomi permettevano di trasferire l’informazione da una sequenza di DNA ad una amminoacidica. Si pensava che i ribosomi fossero specifici per ogni proteina dato che includevano al loro interno RNA, quindi immaginando un grande pool di ribosomi nella cellula. In realtà si è presto scoperto grazie al lavoro di Jacob e Brenner, i quali hanno definito il meccanismo della traduzione, che i ribosomi non sono specifici per le proteine.

L’esperimento che ha portato a questa conclusione è stato il seguente:

• Un ceppo di coli è stato messo a crescere in un mezzo contenete molecole radioattive come zolfo e fosforo radioattivo, in modo che i batteri producessero ribosomi marcati radioattivamente.
• Successivamente coli viene infettato con il fago T2. A seguito dell’infezione coli inizia a produrre al suo interno le proteine del fago.
• A questo punto c’erano due ipotesi in campo: secondo l’ipotesi di Crick, dal momento dell’infezione del fago si genereranno ribosomi nuovi con una marcatura diversa. Invece l’ipotesi che si realizza prevede che i ribosomi mantengano la marcatura precedente all’infezione, e quindi non è il ribosoma stesso a definire la produzione della proteina, ma è l’mRNA a seguito del legame con i ribosomi a dare luogo alle proteine.

Uno shifting della marcatura radioattiva prima e dopo l’infezione del fago ha messo in luce che i ribosomi restano gli stessi e ciò che cambia sono le proteine prodotte.

Unità di trascrizione

Unità di trascrizione: una porzione di genoma che ha sia elementi codificanti che regolatori. Un esempio procariotico è l’operone lac. Si nota la produzione di più di una proteina, infatti l’unità di trascrizione procariotica è di solito policistronica, mentre negli eucarioti è di solito monocistronica (prodotta una sola proteina da ogni unità trascrizionale). Sia eucarioti che procarioti hanno però oltre alla porzione codificante un insieme di regioni regolatorie che normalmente si trovano a monte del sito di inizio della trascrizione e permettono o meno la trascrizione di quella unità. In questo caso il meccanismo dell’operone lac dipende dalla presenza o assenza del lattosio che influenza il legame tra repressore e operatore. Negli eucarioti il sistema è molto più complesso.

Esempio di unità semplice di trascrizione negli eucarioti: gene della betaglobina. Esso comprende esoni (rettangoli azzurri), introni (barre) e regioni di controllo a monte del sito di inizio della trascrizione, quest’ultimo indicato con "Cap site"; il 3’ del gene della betaglobina è indicato come "Poly(A) site", oltre il quale il trascritto viene modificato aggiungendo una coda di poli-A. Questa unità di trascrizione comprende quindi una regione a monte del 5’ e una a valle del 3’.

In particolare, le regioni di controllo a monte negli eucarioti possono essere a distanze molto grandi, ad esempio in questo caso ci sono 50 kb tra i due elementi regolatori che sono indispensabili per la trascrizione, seppure stiano lontani dal sito di inizio della trascrizione, infatti sono comunque parte dell’unità di trascrizione. Se il gene della betaglobina viene mutagenizzato portando all’insorgere di anemie e betatalassemie, le mutazioni responsabili possono avvenire sia nelle porzioni codificanti che nelle porzioni regolatorie! Quindi anche queste ultime sono causa di patologie.

In questo caso la mutazione puntiforme “c” di una base cade su un esone: essa può portare alla mutazione di un amminoacido, anche se ci sono tre triplette per amminoacido quindi non è detto. Un amminoacido diverso potrebbe:

• Portare alla produzione di una proteina non catalicamente attiva.
• Non avere influenza sull’attività catalitica della proteina, ma diminuirne l’efficienza.
• Modificare strutturalmente un dominio. Le interazioni proteina-proteina ma anche proteina-DNA sono indispensabili per l’attività della proteina stessa e quindi questa modificazione può portare a deficit seri.

Una mutazione intronica come “d” su una porzione non codificante spesso è meno dannosa rispetto a una mutazione su un esone. Esse però non vanno sottovalutate perché all’interno degli introni ci sono sequenze molto importanti che permettono lo splicing del trascritto. Se la mutazione cade in regioni critiche che ad esempio interferiscono con lo splicing, insorgono problemi anche per una mutazione intronica.

Per lo splicing sono indispensabili le regioni a cavallo tra esone e introne. Queste regioni sono altamente conservate e per ovvie cause non possono essere conservate negli esoni poiché essi sono codificanti e quindi qualsiasi sequenza nucleotidica serve per la produzione della proteina, invece l’introne non avendo questo ruolo ha la possibilità di contenere regioni che facciano da driver al meccanismo di splicing.

Le unità di trascrizione negli eucarioti possono essere molto più complesse perché si può avere la generazione di isoforme proteiche diverse all’interno dello stesso organismo. A seconda della linea cellulare e quindi del differenziamento cellulare di quella linea si possono esprimere mRNA diversi nelle varie cellule: questo fenomeno è chiamato splicing alternativo. Delle mutazioni come quella sull’esone 3 “b” possono essere deleterie per la prima isoforma (mRNA₁) mentre non esserlo per la seconda (mRNA₂) dove l’esone 3 subisce splicing.

La complessità del sistema è ulteriormente aumentata dal fatto che innanzitutto tutti e due i filamenti sono codificanti lungo una certa finestra genetica come quella in figura; alcuni trascritti vengono codificanti da un filamento mentre altri dall’altro filamento. La trascrizione va sempre in direzione 5’-3’, ma nella stessa porzione genica ci possono anche essere dei trascritti overlappanti, ovvero quella porzione genica codifica sia in un filamento che nell’altro per trascritti diversi. Allo stesso tempo ci possono essere situazioni ancor più complesse ma comuni come quella in figura: una certa porzione genica serve per trascrivere un protein-coding RNA dal sito di inizio (TSS: transcription start site) rappresentato da una bandierina verde. All’interno di esso stesso c’è un altro promotore che porta alla trascrizione di un non-coding RNA (ncRNA: RNA non codificante).

Le varie porzioni introniche non sono semplicemente junk DNA (DNA con poco significato dal punto di vista fisiologico) come si pensava una volta, spesso gli introni vengono processati per dar luogo ad altri piccoli RNA con una funzione. In figura si osserva la generazione di microRNA (miRNA), small nucleolar RNA (snoRNA) o altri piccoli RNA. La funzione di miRNA è di regolazione dei livelli trascrizionali perché a seguito del loro legame potrebbero down-regolare sia l’espressione del trascritto da cui essi stessi derivano che l’espressione di altri trascritti del genoma. Altri piccoli RNA hanno ruolo indispensabile nello splicing. Se si osserva l’altro filamento di questa finestra, si nota che anch’esso viene trascritto e dà origine a dei trascritti che hanno un significato biologico. Correlare una determinata porzione genica con uno specifico fenotipo o una specifica funzione negli eucarioti è molto difficile.

Sequenziamento del genoma umano

Una delle ultime versioni risalente al 2019 del sequenziamento del genoma umano (progetto Genoma Umano) mostra 349 gaps (porzioni non ancora identificate) non ancora sequenziati. Erano stati identificati circa 60000 geni con un numero totale di trascritti di 228000, più del triplo rispetto al numero dei geni proprio per il fenomeno di splicing alternativo. Solo 20000 sono geni che codificano per proteine, mentre fino a qualche anno fa si pensava non ci fosse nulla al di fuori dei geni che codificano per proteine. Sta invece venendo in luce che essi sono 1/3 rispetto al totale dei geni.

Quindi non si può più pensare che solo i geni che codificano per proteine abbiano un ruolo funzionale. I trascritti che codificano per le proteine sono 84000 e circa 18000 long non-coding RNA, di cui il numero di cui si è individuata la funzione è bassissimo. Gli small non-coding RNA sono circa 8000 ed esistono circa 15000 pseudogeni. Infine, vi è un numero molto elevato di varianti sia strutturali che piccole varianti. La complessità del genoma tra procarioti ed eucarioti cambia poiché il sistema procariotico è detto “non restrittivo” ovvero il genoma procariotico è facilmente accessibile da parte di RNA polimerasi, la cui attività viene regolata comunque da alcune sequenze come si è visto con l’operone lac; esse però sono molto semplici: a seguito del legame di un repressore o meno permettono all’RNA polimerasi di trascrivere quella porzione genica, quindi il sistema è facilmente accessibile, senza impedimento forte.

Invece il sistema eucariotico è detto “restrittivo”: normalmente un RNA polimerasi non può accedere al genoma poiché esso è altamente complessato e strutturato. Si esaminerà infatti cosa è la cromatina e come essa possa bloccare o meno gli eventi trascrizionali, il compattamento del DNA, i fattori che permettono di reclutare RNA polimerasi sul genoma. I macrocomplessi formati possono includere centinaia di proteine (come il mediator, complesso che trasporta la polimerasi) e permettono la trascrizione. Tutti i fattori devono lavorare in modo cooperativo.

Epigenetica e regolazione genica

L’epigenetica comprende tutte le modificazioni sia del DNA e delle proteine legate al DNA (come metilazioni ed acetilazioni) che influenzano gli eventi trascrizionali. I nucleosomi (grandi strutture attorno a cui il DNA si avvolge per essere compattato) possono venire modificati post-traduzionalmente con modifiche epigenetiche e rendere quindi possibile a una certa porzione genica di essere o meno trascritta. Allo stesso modo anche il DNA può essere metilato in alcune regioni e permettere quindi la sua trascrizione o meno. L’epigenetica è trasmessa da cellula madre a cellula figlia durante la formazione di una nuova cellula figlia.

In figura si vede che fattori trascrizionali che cooperano con RNA polimerasi possono essere attivati e arrivare nel nucleo dove permettono sia il reclutamento dell’RNA polimerasi in una certa regione che il decompattamento della cromatina. A seguito della trascrizione una serie di eventi tra cui lo splicing (ma non solo) permettono la produzione di una serie di trascritti diversi uno dall’altro che vengono a loro volta riportati verso il citoplasma e possono o meno essere tradotti. Lo splicing è quindi un ulteriore meccanismo di variabilità genetica.

Inoltre, i geni non vengono espressi tutti alla stessa velocità. Ci sono due macrocategorie di geni: i geni housekeeping che vengono sempre espressi a livello basale e continuo, indispensabili per l’attività della cellula. Il loro livello trascrizionale è costante e la loro espressione meno veloce rispetto a geni che devono essere trascritti solo in seguito a un determinato stimolo che sono indotti prontamente. Il loro livello trascrizionale aumenta molto velocemente a seguito di uno stimolo, di solito hanno anche una corta emivita, ovvero vengono eliminati velocemente dalla cellula affinché essa possa nuovamente rispondere a uno stimolo se necessario. Il trascrittoma (espressione genica della cellula) quindi si modifica a seconda dell’espressione basale o indotta di questi due tipi di geni.

Riassumendo, si possono controllare i livelli di proteine nelle cellule, sia andando a interferire:

• con il livello di trascrizione
• con il livello di traduzione
• con il livello di turnover sia delle proteine che dei trascritti, quindi con la loro emivita (velocità di formazione e degradazione)
• con modificazioni post-traduzionali

Il proteoma, ovvero il contenuto proteico delle cellule, può essere modificato sia dall’editing dell’RNA sia dallo splicing alternativo. La compartimentazione delle proteine permette che ci siano un accumulo di proteine e trascritti per differenziare certe funzioni con livelli di espressione di proteine diversi da compartimento a compartimento. Il fenotipo è determinato sia dai geni che da fattori epigenetici. I trascritti derivanti dal genoma determinano il fenotipo ma la grande quantità di trascritti e di proteine e delle modificazioni post-traduzionali che ci possono essere aumenta la rete di interconnessioni che quindi deve essere un equilibrio affinché la cellula riesca ad organizzare tutta la sua attività cellulare. Quindi il dogma centrale è troppo semplice.

La cromatina di per sé è un repressore della trascrizione perché impedisce alla RNA polimerasi di trascrivere e tutto il DNA è organizzato in cromatina. L’epigenetica ha un suo ruolo non solo nell’organizzazione della cromatina ma anche nell’espressione diretta di alcune regioni del DNA. Ci sono molti più trascritti che geni codificanti le proteine e le unità trascrizionali possono essere sovrapposte. Inoltre, i non-coding RNA hanno una funzione molto importante e non sono semplicemente spazzatura. Durante questo corso si cercherà di mettere in fila tutti questi eventi per capire come il tutto venga regolato.

RNA Polimerasi

Scoperta delle tre RNAP eucariotiche

Nel 1969 fu scoperta che le RNA polimerasi eucariotiche sono non una ma tre, attraverso un esperimento che sfrutta la cromatografia a scambio ionico. Questa tipologia di cromatografia in colonna utilizza una matrice funzionalizzata cationica o anionica (differiscono per la carica) la quale "dà supporto" avendo una certa densità e porosità. All'interno della colonna, nel caso specifico, è stato caricato un estratto proteico da lievito, ottenuto separando il contenuto proteico da acidi nucleici ed organelli, e sono stati fatti dei lavaggi per allontanare le sostanze non legate (come in ogni cromatografia). Successivamente è stata aumentata progressivamente la concentrazione del solfato di ammonio in modo da aumentare la forza ionica/salinità e spiazzare le molecole legate, le quali sono eluite a seconda della loro forza ionica a tempi diversi.

Nel grafico si osserva il risultato dell'esperimento; sull'asse x sono riportare le 100 frazioni proteiche raccolte nell'eluizione, ottenute raccogliendo fisicamente in diversi tubi le varie frazioni eluite. In verde è riportata l'assorbanza misurata a 280 nm di ciascuna frazione. A 280 nm si ha il picco di assorbimento delle proteine, dunque l'assorbanza misurata è rappresentativa del pool proteico di ciascuna frazione; a 260 nm si osserva il picco di assorbimento degli acidi nucleici. Questi sono picchi che riferiscono a tutti gli amminoacidi/basi azotate e non ad un unico nello specifico. Nelle prime frazioni (fino alla 20) si osserva un alto segnale e dunque una grande quantità di proteine che sono eluite da una bassa forza ionica; altre proteine fuoriescono a forza ionica maggiore.

Oltre alla misura dell'assorbanza, è stata testata la capacità di ciascuna frazione di incorporare in un filamento nascente un nucleotide trifosfato marcato radioattivamente, dunque in grado di sintetizzare RNA, fornendo tutte le condizioni necessarie a tale attività (riportata in rosso nel grafico). Sono visibili 3 picchi di attività enzimatica corrispondenti alle varie RNA polimerasi denominate I, II, III in base alla loro fuoriuscita; le frazioni dalla 48-58 contenevano la I, 61-70 la II, 72-82 la III.

Fu anche notato che le polimerasi si compartimentalizzavano in zone differenti nel nucleo, quindi non avevano una distribuzione omogenea, evidenziando come la RNA pol I fosse nucleolare (nei nucleoli), mentre le altre presenti a livello nucleoplasmatico (esternamente ai nucleoli). Ciò fu dimostrato caricando non un estratto proteico totale, ma andando a separare le componenti nucleolari dalle nucleari e osservando quale polimerasi è arricchita in una componente piuttosto che in un'altra.

Funzioni delle RNAP

Ogni RNA pol ha una funzione precisa e un pool trascrizionale differente.

• RNA pol I sintetizza il precursore del rRNA chiamato 45S, il quale è poi processato alle forme mature 28S, 18S, 5.8S.
• RNA pol II sintetizza la maggior varietà di RNA essendo responsabile della sintesi dei:
  • hnRNA (heterogeneous nuclear RNA) i precursori non maturi degli mRNA contenenti gli introni che sono co-trascrizionalmente rimossi.
  • snRNA necessari alla maturazione degli hnRNA, necessari allo splicing.
  • miRNA regolatori dell'espressione genica. Come detto precedentemente spesso miRNA e snRNA derivano dagli introni degli hnRNA.
• RNA pol III trascrive:
  • tRNA
  • 5S rRNA che ha un locus differente rispetto al 45S
  • Piccoli RNA, alcuni dei quali coinvolti anche nello splicing.

Le 3 polimerasi si differenziano anche per la loro predisposizione ad essere o meno inibiti dall’α-amanitina, una tossina molto utilizzata in biologia molecolare proprio per lo studio delle RNA pol. Facendo saggi biochimici di attività dell’RNA polimerasi si può osservare come alcune siano sensibili alla tossina mentre altre no, indicando differenze funzionali e strutturali tra le tre polimerasi.