Biologia molecolare - Duplicazione 1

DUPLICAZIONE DEL DNA

La struttura a doppia elica del DNA suggerisce già in parte come il processo di

duplicazione avvenga: i stessi Watson and Crick, pubblicando sulla rivista

“Nature”, affermarono che lo specifico appaiamento, da loro ipotizzato,

suggeriva immediatamente un meccanismo di copia del materiale genetico. In

altre parole, il fatto stesso che i due filamenti siano complementari suggerisce

che questo possa essere un meccanismo di copia. Si decide dunque di cercare

di capire come andasse avanti tale meccanismo di copia a partire da un

filamento stampo. Primo problema fu quello di capire come il nuovo filamento

sintetizzato, a partire da quello stampo, riesca poi ad appaiarsi a quello vecchio

per formare la doppia elica; su tale problema vennero presentate 3 ipotesi:

1. Meccanismo conservativo nel quale le due nuove doppie eliche fossero

costituite una da solo DNA vecchio e l’altra solo da DNA nuovo

2. Meccanismo semiconservativo nel quale le due nuove doppie eliche

fossero costituite ciascuna di un filamento vecchio e di uno nuovo

3. Meccanismo dispersivo nel quale i due filamenti di nuova sintesi fossero

costituiti in parte di DNA vecchio ed in parte di DNA nuovo

1958 l’esperimento di Meselson e Stahl: si basa sulla marcatura del DNA

Vennero fatte crescere per una generazione cellule batteriche completamente

in un mezzo di coltura contenente solo l’isotopo 15 dell’azoto.

Tempo zero = tutte le molecole di DNA marcate con l’azoto 15.



Successivamente venne cambiato il mezzo di coltura con uno completamente

nuovo contenente solo azoto 14 e le cellule batteriche vengono nuovamente

fatte crescere per una intera generazione (lasciati duplicare una sola volta).

Si nota che le cellule di nuova sintesi contengono azoto 14



Le molecole di DNA vengono così separate su un gradiente di densità di cloruro

si cesio secondo il peso dell’isotopo che contenevano. Da questa prima analisi

viene fuori un’unica banda di DNA a densità intermedia: l’ipotesi conservativa

viene completamente scartata perché avremmo dovuto avere 2 molecole di

DNA di cui una completamente marcata con azoto 15 e l’altra con azoto 14

(avremmo dovuto avere due bande diverse e distinguibili).

Per decidere tra le 2 ipotesi restanti, le cellule batteriche vengono coltivate per

un’altra generazione in azoto 14. I risultati aspettati avrebbero dovuto essere

rispettivamente:

Modello Dispersivo > avrebbe continuato a mostrare un'unica banda

 perché tutte le molecole avrebbero dovuto contenere parte di azoto 15 e

parte di azoto 14 rendendole di fatto indistinguibili;

Modello Semiconservativo > mostra due bande distinte, una ibrida e

 una completamente leggera, che è ciò che accadde realmente.

Le molecole della generazione precedente (che erano ibride) si aprono e fanno

tutte da stampo. Nella provetta ora abbiamo 4 doppie eliche in totale, divise

in due tipi: contenente per ogni elica un filamento marcato con

 2 doppie eliche Ibride,

N14 ed uno con N15

2 doppie eliche Leggere in cui entrambi i filamenti sono marcati con N14



Le due doppie eliche ibride sono indistinguibili tra di loro così come le 2 doppie

eliche leggere lo sono tra di loro ma le ibride e le leggere tra loro sono

distinguibili; questo porta quindi ad avere 2 bande.

Il processo di duplicazione può essere diviso in tre fasi:

l’inizio

 l’allungamento (è la parte più conservata in tutti gli organismi)

 la terminazione



L’inizio e la terminazione variano tantissimo tra procarioti ed eucarioti e tali fasi

sono finemente controllati.

La sintesi del DNA è catalizzata dalla DNA polimerasi, enzima che

catalizza il legame fosfodiesterico. Tutte le DNA polimerasi per funzionare

hanno bisogno di:

uno stampo

 un innesco

 i 4 deossinucleosidi trifosfato (monomeri della reazione)



Il substrato che viene riconosciuto della DNA polimerasi è il complesso

innesco-stampo (un qualunque filamento di DNA con un

oligonucleotide appaiato con lo stampo ed estremità OH libera).

Tutte le DNA polimerasi catalizzano la polimerizzazione del DNA in direzione 5’-

3’: il primo nucleotide presenta il fosfato in 5’ libero mentre l’ultimo nucleotide

ha -OH in 3’ libero. I nuovi nucleotidi possono essere aggiunti sono al -OH in 3’.

Ovviamente il filamento stampo corre in maniera antiparallela.

Entra il deossinucleotide nella DNA pol e si appaia con il primo nucleotide libero

(con la base) dello stampo. L’oligonucleotide del primer ha un -OH 3’ libero che

attacca il fosfato in alfa del nucleotide entrante, facendo fuoriuscire il

pirofosfato. Quest’ultimo viene idrolizzato da una pirofosfatasi e libera energia.

Questa reazione (attacco dell’ossidrile in 3’ al fosfato) non è una reazione

energeticamente favorevole (avendo un ΔG poco negativo vicino allo 0) e da

sola non sarebbe sufficiente per mandare avanti la reazione. Viene però

accoppiata dal meccanismo stesso della reazione che prevede l’idrolisi di un

legame ad altra energia, ovvero quella del pirofosfato. L'idrolisi del pirofosfato

è, quindi, l'evento cruciale che rende il ΔG complessivo fortemente negativo,

rendendo la reazione energeticamente spontanea e irreversibile. Questo è il

motivo per cui non è possibile usare nucleotidi mono o di fosfato (anche

quest’ultimo lascerebbe un unico fosfato che non può essere idrolizzato).

La DNA polimerasi si avvale di due cofattori metallici divalenti, generalmente

Mg2+ o Zn2+, presenti nel suo sito attivo e senza i quali la duplicazione non

avviene. Questi due ioni cooperano per favorire la catalisi attraverso due ruoli

principali:

Primo ione metallico (stabilizzazione): Poiché i nucleotidi trifosfato

 presentano molte cariche negative concentrate sui gruppi fosfato, il

nucleotide entra nel sito attivo già coordinato da uno ione metallico.

Questo cofattore scherma e stabilizza le cariche negative, riducendo la

repulsione elettrostatica e orientando correttamente i fosfati beta e

gamma (che verranno rilasciati come pirofosfato).

Secondo ione metallico (attivazione): Questo cofattore interagisce

 direttamente con il gruppo ossidrile in 3' -OH del primer. La sua presenza

indebolisce il legame tra l'ossigeno e l'idrogeno, rendendo l'ossigeno

molto più nucleofilo e facilitando così il suo attacco al fosfato alpha del

nucleotide entrante.

La DNA polimerasi deve controllare la geometria delle basi

La DNA polimerasi non è un enzima specifico per una singola base azotata,

poiché deve essere in grado di legare tutti e quattro i nucleotidi (basi) e

catalizzare il legame fosfodiesterico tra tutti. Il suo meccanismo di controllo,

una volta entrato il nucleotide, si basa quindi sul riconoscimento geometrico

(non sulla lettura della base): la DNA polimerasi controlla che gli appaiamenti

A+T e C+G occupino un certo spazio. Se l’appaiamento è giusto, il filamento

che si sta ora sintetizzando si viene a trovare in una posizione ottimale

all'interno del sito attivo che permette due controlli strutturali simultanei:

Il controllo dello zucchero: L'enzima misura la distanza fissa (pari a

 10,8 Å) tra i carboni C1' dei deossiribosi dei due filamenti opposti,

verificando che la coppia non sia troppo larga o troppo stretta.

Il controllo del solco minore: La DNA polimerasi inserisce specifici

 amminoacidi (Arginina e Glutammina) all'interno del solco minore della

nuova coppia appena accennata. Qui instaura legami a idrogeno con

atomi universali (l'N3 delle purine e l'O2 delle pirimidine), che si trovano

nella posizione geometrica corretta solo se le basi sono perfettamente

allineate.

Solo se entrambi i controlli danno esito positivo, l'enzima subisce un cambio

(induced fit)

conformazionale di chiusura che avvicina i reagenti e permette la

catalisi del legame fosfodiesterico: questa "stretta" allinea

millimetricamente il gruppo ossidrile 3' dell'ultimo nucleotide del

primer con il fosfato alpha del nucleotide entrante, portandoli alla

giusta distanza chimica per permettere l'attacco nucleofilo e la

conseguente formazione del legame fosfodiesterico.

Se entra un nucleotide sbagliato nel sito attivo, la DNA polimerasi non può

bloccarne fisicamente l'accesso, poiché non esiste una tasca discriminatoria

iniziale. Tuttavia, l'appaiamento errato impedisce la formazione delle giuste

interazioni geometriche: lo zucchero non si posiziona correttamente e il gruppo

ossidrile (3'-OH) rimane troppo lontano e mal orientato rispetto al fosfato alpha

del nucleotide entrante. Questo disallineamento attiva un rigoroso controllo

cinetico: la costante di velocità della reazione di polimerizzazione per un

nucleotide errato crolla drasticamente, risultando fino a 10.000 volte meno

(quindi può avvenire ma con una velocità molto più bassa) rispetto a

favorita

quella di un nucleotide corretto. A causa di questo immenso rallentamento

chimico, la reazione non riesce a scattare e il nucleotide sbagliato ha tutto il

tempo di dissociarsi e uscire spontaneamente dal sito attivo prima che si formi

il legame fosfodiesterico.

Lo stesso tipo di controllo cinetico viene applicato ai ribonucleotidi. Questo

controllo è cruciale perché i ribonucleotidi sono molto più concentrati nella

cellula rispetto ai desossiribonucleotidi, rendendo statisticamente molto

probabile il loro ingresso nel sito attivo. Tuttavia, la DNA polimerasi non deve

catalizzarne l'incorporazione. Quando entra un ribonucleotide, anche se la sua

base azotata si appaia correttamente con lo stampo, la presenza del gruppo –

OH in posizione 2' dello zucchero crea un ingombro sterico insormontabile. Nel

sito attivo dell'enzima è presente un amminoacido discriminatore (una

tasca molto stretta) che collide fisicamente con questo –OH in 2'. Questo

scontro sposta lo zucchero dalla sua corretta posizione geometrica; di

conseguenza, l'ossidrile in 3' dell'innesco non riesce a raggiungere la d