Biologia molecolare

INTRODUZIONE ALLA BIOLOGIA MOLECOLARE

La doppia elica forma un giro completo ogni 10 paia di basi.

Watson e Crick hanno ipotizzato che il DNA è il depositario delle informazioni genetiche per la

sintesi delle proteine, che è capace di auto-duplicazione ed che sia il centro organizzativo per le

attività cellulari:

! nel processo di auto duplicazione, i legami tra le basi si rompono e ogni filamento fungerà da

stampo per il filamento figlio.

Un tratto di DNA è chiamato gene a e grazie alla complementarità ciascuno dei due filamenti fungerà

da stampo per la duplicazione dell’altro. Quindi si verranno a formare due molecole di DNA identiche

a quella di partenza.

All’interno della cellula il DNA può trovarsi sotto forma lineare (quasi mai), circolare oppure

compattato in super avvolgimenti. Ogni struttura presenta una diversa mobilità durante l’elettroforesi.

Quando il DNA viene denaturato i due filamenti assumono degli avvolgimenti casuali. Esistono due

possibili superavvolgimenti:

! superavvolgimento positivo è la forma del DNA a doppia elica destrorsa. È attorcigliato saldamente

nella direzione della mano destra finché l'elica non crea un nodo.

! superavvolgimento negativo è la forma a doppia elica del DNA mancino.

Esistono dei particolari enzimi, detti topoisomerasi, che agiscono sui superavvolgimenti del DNA.

Esistono delle topoisomerasi di tipo uno che creano una rottura transitoria su uno dei due filamenti in

modo tale che l'altro possa ruotare e svolgersi del super avvolgimento. Questi vengono usati durante

la trascrizione e la duplicazione.

Mentre le topoisomerasi di tipo due creano una rottura di entrambi i filamenti per permettere

l'inserzione di un segmento di DNA. Questi enzimi sono necessari per separare le molecole di DNA

prima che i cromosomi si separino durante la mitosi.

Questi enzimi possono formare sciogliere i nodi e formare concatenazioni di anelli. Pagina 9 di 46

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La struttura tridimensionale del DNA viene descritta e proposta da Watson e Crick. Essa presenta una

forma definita forma B, ovvero una doppia elica antiparallela destrorsa. Esistono anche altre strutture

che il DNA può assumere:

! Forma A è favorita in soluzioni povere di acqua dove il DNA si organizza in una doppia elica

destrorsa più larga contenente 11 residui per ogni giro. Inoltre il piano delle basi è inclinato di 20°

e questo provoca un solco maggiore molto più profondo. I legami glicosidici sono di tipo quanti e

lo zucchero presenta il carbonio 2 Guida piano dell'anello (mentre nella forma B è il carbonio tre

adesso da fuori).

! La forma Z è caratterizzata da un avvolgimento sinistrorso dove ogni giro contiene 12 basi, il solco

maggiore è appena accennato mentre quello minore è molto stretto e profondo. Quindi nel

complesso la forma Z è una struttura sottile allungata.lo scheletro covalente assume un andamento

a zig-zag. Alcune zone del DNA assumono una forma Z molto più facilmente di altre, in particolare

quelle molto ricche di citosina e guanina oppure le zone ricche di 5-metil-citosina e 5-metil-

guanosina.

DNA vs RNA

Le principali differenze tra DNA ed RNA sono:

! Lo zucchero che tra lo scheletro: nel DNA è il desossiribonucleico mentre nell'RNA e ribosio

! Nel DNA è presente la timina mentre nell'RNA l’uracile

! Il DNA è una doppia elica mentre l'RNA è una elica sola

Ma i due acidi nucleici hanno anche delle cose in comune:

! La direzione dei filamenti e sempre 5’-3’. Anche nell’RNA, i filamenti sono formati da

nucleotidi monofosfati che hanno perso il pirofosfato dopo la reazione di condensazione.

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! Il gruppo OH- a livello del carbonio tre di entrambi gli zuccheri è coinvolto nell'attacco

nucleofilo con il gruppo fosfato in posizione alfa del nucleotide successivo per la formazione

del legame fosforodiestere tra i due nucleotidi.

! Questa caratteristica in comune che hanno RNA e DNA a singolo filamento e quello di

assumere una struttura detta forcina grazie all'interazione tra sequenze palindromiche, ovvero

sequenze che si possono leggere ugualmente andando da destra a sinistra e da sinistra a destra.

Quindi sono delle sequenze che presentano una simmetria binaria; questo permette un

appaiamento tra le zone complementari portando alla formazione della forcina (forma

2

bidimensionale ).

"

2 La forma tridimensionale di una struttura a forcina ricorda molto una L rovesciata. Questo è il caso

dei tRNA. Pagina 11 di 46

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Replicazione del DNA

Questo processo inizia con lo srotolamento della doppia elica da parte di un’elicasi. Ogni filamento

servirà da stampo per la DNA polimerasi, portando due molecole con un filamento stampo originario

à

e uno neosintetizzato replicazione semi-conservativa.

Il processo inizia a livello delle origini di replicazione dove si forma una forcella di replicazione a Y.

La sintesi da parte della polimerasi è sempre in direzione 5’-3’. Il processo consiste nell’aggiunta di

dNTPs legandoli al 3’OH libero sul filamento nascente, che viene fornito da un primer a RNA. La

sintesi procede in maniera continua sul filamento con direzione 5’-3, verso la forcella di replicazione

(filamento guida o leading), mentre sul filamento con direzione 3’-5’ procede in maniera discontinua

in quanto la polimerasi si muoverà in senso contrario e necessita di una serie di passaggi (semi-

discontunua):

1. Sintesi di più primer per fornire il 3’OH da usare durante la sintesi del filamento

2. Sintesi di frammenti di 100-1000 bp (frammenti di Okazaki) che poi verranno ligati insieme

dalla DNA ligasi per formare il filamento neosintetizzato.

La replicazione del DNA inizia sempre da un punto specifico che viene chiamato origine C (OriC);

mentre negli eucarioti è chiamato replicone. Nei batteri è presente un solo OriC; mentre negli eucarioti

più repliconi.

A livello dell’origine, i due filamenti parentali si separano e inizia la sintesi del filamento

complementare, portando alla formazione di una struttura chiamata forcella di replicazione (o

struttura a theta nei batteri; bolla di replicazione negli eucarioti). L’origine ha una funzione simile a

quella del promotore, ovvero legare le proteine necessarie alla replicazione.

La replicazione è bidirezionale e le forcelle si muovono in direzioni opposte fino ad incontrarsi a

livello della sequenza di terminazione, nel punto opposto all’origine, dove la replicazione termina.

La replicazione possiamo dividerla in quattro fasi principali:

1. Legame di circa 30 copie di una specifica proteina di inizio a una sequenza ripetuta a livello

dell'origine, ricca in A e T, costituendo un complesso proteico avvolto dal DNA inducendo

la separazione dei filamenti Pagina 12 di 46

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2. Quindi entra l'elicasi, avviene l'attacco delle SSB e il reclutamento delle proteine necessarie

per la formazione della forcella;

3. Le due forcelle si incontrano a livello di una particolare regione, detta ter, dove la

replicazione termina, gli enzimi si staccano e le due molecole di DNA si dividono.

Gli elementi essenziali per la replicazione del DNA sono: i dNTP; primer che fornisce il 3’OH- libero

per catalizzare la reazione di polimerizzazione (reazione fosfodiesterica) del filamento; un filamento

stampo in base al quale sarà sintetizzato il neofilamento; la polimerasi.

Polimerasi

La sintesi del nuovo filamento avviene grazie a delle DNA polimerasi. Nei batteri esistono tre forme

diverse:

! polimerasi I, ovvero la più abbondante. Partecipa alla riparazione del DNA e rimuove i primer del

filamento in ritardo sostituendoli con DNA

! polimerasi II, la cui funzione non è ancora nota

! 3

polimerasi III, quella che sintetizza il DNA chiamata anche beta-replicasi. L’oloenzima polimerasi

III presenta una struttura molto più grande rispetto alle altre due, come mostrato nell’immagine.

Mentre negli eucarioti ne esistono diverse tipologie. Nel complesso, le polimerasi sono divise in 4

classe in base alla comparazione tra le loro sequenze (A, B, X e Y). In particolare, le polimerasi della

famiglia B sono definite ad alta fedeltà perché possiedono un’attività esonucleasica 3’-5’ essenziale

per l’attività di correzione bozze; di questa classe fa parte la polimerasi alfa che prende parte alla

replicazione del DNA nucleare.

3 Un oloenzima è una proteina nella sua forma attiva, prodotta dall'unione dell'apoenzima (proteina

senza cofattori) con tutti i suoi cofattori. Pagina 13 di 46

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Alcune polimerasi coinvolte nella riparazione e nella ricombinazione non sono ad alta fedeltà,

soprattutto quelle della famiglia X e Y. Queste polimerasi possono essere utili in alcuni casi:

1. Continuare la sintesi del neofilamento partendo da uno stampo danneggiato = sintesi

translesione

2. Contribuire alla diversità di sequenza delle immunoglobuline

L’oloenzima si compone della subunità catalitica e di altre tre parti accessorie, tra le quali la pinza

beta è la più importante. La pinza beta ha il compito di mantenere la polimerasi associata al DNA

stampo per lunghi tratti, grazie alla sua struttura a ciambella attraverso la quale passa il DNA. Una

volta che la polimerasi III raggiunge l'estremità del frammento di Okazaki, l'enzima si stacca e viene

riciclato su un'altra pinza beta che aspetta un altro altro punto del filamento.

Più semplicisticamente, possiamo paragonare la struttura della polimerasi a una mano: i domini dita

e pollice si avvolgono intorno al DNA tenendolo in posizione in maniera tale che possa passare

attraverso il sito attivo (dominio palmo) dove vengono catalizzate tutte le reazioni di polimerizzazione

4

in presenza di ione Mg2+ che interagiscono con il gruppo carbossilico di due ASP nel dominio del

palmo contribuendo a mantenere lo ione in posizione:

! dominio dita: presenta un ripiegamento a 40° e serve a stabilizzare il legame del nuovo nucleotide

con il filamento stampo

! dominio mano: contiene il dominio catalitico e un sito per l’attività esonucleasica per la correzione

bozze. Il DNA presente in questo dominio ha una ripiegatura a 30°

Come si assembla il complesso della DNA polimerasi III, ovvero il replisoma?

1. si apre il filamento # #

4 Lo scopo dello ione è quello di legare il primer e attivare il gruppo 3 OH facilitando l attacco

nucleofilo al fosfato alfa del trifosfato. Pagina 14 di 46

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2. si attacca la pinza beta con la subunit&agra