Biologia delle cellule staminali e della rigenerazione (BSR-A e BSR-B)

Biologia delle cellule staminali e della rigenerazione (BSR-A e BSR-B)

Introduzione ai meccanismi di regolazione della rigenerazione tissutale

Proff. Lasagni, Dello Sbarba, Parronchi. A.A. 2022/2023 - Meccanismi di regolazione della rigenerazione tissutale. Parte 1 prof.ssa Lasagni. A.A. 2022/2023 - Parte 1. Prof.ssa Lasagni. Meccanismi di regolazione della rigenerazione tissutale – (Lez.1/2) 29.09 e 03.10.

Si parla dei meccanismi comuni ai processi rigenerativi ovunque essi avvengono, ogni tessuto poi ha delle caratteristiche indipendenti chiaramente. Per quanto riguarda quello che si tratta in questo corso è di parlare dei meccanismi rigenerativi e riparativi che avvengono nel rene.

Definizioni e differenze tra rigenerazione e riparazione

Partiamo con degli aspetti generali, parlando di definizioni. Infatti, rigenerazione è una parola ambiziosa, ma i processi rigenerativi veri e propri nel mondo animale sono molto rari. Con rigenerazione intendiamo la rigenerazione di porzioni cellulari, come l’assone di una cellula nervosa, oppure rigenerazione di tipo tissutale, quando guardiamo cosa avviene nei tessuti, rigenerazione d’organo quando si ha rigenerazione di un intero organo che perde una sua porzione. In organismi posizionati in basso evolutivamente si assiste anche a rigenerazione completa dell’organismo.

Distinguiamo allora cosa intendiamo invece con riparazione, diversa parola da rigenerazione. La differenza infatti è che la rigenerazione porta a un ripristino perfetto sia strutturale che funzionale in cui si dice che rigeneriamo le cellule nobili dell’organo o tessuto, mentre nella riparazione non si restituisce la funzione, solo l’integrità strutturale, come la cicatrice. Quasi mai si parla di rigenerazione senza riparazione però, e cercare di spostare e dividere questi due fattori è un potenziale approccio terapeutico.

Capacità rigenerativa negli organismi

La rigenerazione, come abbiamo accennato, non è uniformemente distribuita. Ci sono organismi più atti a rigenerare alcune o tutte le parti del corpo, mentre via via passando ai mammiferi questa capacità rigenerativa si perde. Il potenziale rigenerativo non è neanche ben distribuito nell’organismo stesso e nemmeno nelle varie fasi della vita. Infatti, è molto spiccato nelle fasi precoci embrionali o nella primissima infanzia, mentre via via che l’organismo accresce, la rigenerazione si perde.

Evoluzionisticamente, essere un organismo che rigenera è un vantaggio. Tuttavia, man mano che si osservano organismi superiori, si nota che è un meccanismo che si perde. Ci sono alcune ipotesi che cercano di spiegare questo fenomeno. Ad esempio, c’è chi ritiene che la rigenerazione di un tessuto, richiedendo tempo, possa mettere più a repentaglio la vita dell’organismo rispetto al lasciar perdere l’organo perduto. Oppure, che rigenerare non è un vantaggio selettivo perché la struttura che si perde è persa molto raramente, o quella perdita è compensabile in modo più semplice, come il rene, o in generale quando parliamo degli organi doppi.

Ipotesi sulla mancanza di capacità rigenerativa nei mammiferi

Per alcuni tessuti, come il sistema nervoso, c’è anche l’ipotesi che nei mammiferi e organismi superiori questa assenza di capacità rigenerativa sia legata alla necessità di contenere i processi infiammatori. Un’infezione al SNC infatti è quasi del tutto irrisolvibile perché è un tessuto protetto dal SI (sistema immunitario), e il processo infiammatorio attiva le cellule gliali che vanno a ripulire le cellule infette proteggendo il resto del tessuto. Nell’organo dei mammiferi c’è una iperattivazione della glia che da un lato è benefica perché facilita l’eliminazione di parassiti, virus ecc., ma è anche un processo che inibisce la rigenerazione del neurone. Nuovamente si tratta di compensare qualcosa di severo, un’infezione, ma perdendo la rigenerazione.

Processi rigenerativi e danno tissutale

Detto questo, cominciamo a entrare nel dettaglio di quelli che sono i processi rigenerativi, partendo dai primissimi istanti successivi a un danno di tessuto. Esistono sistemi rigenerativi che si attivano infatti da un danno, di ogni tipo, tossico, un trauma fisico, un danno ipossico, e diciamo che qualunque sia il tipo di danno alcuni meccanismi che si innescano sono sempre gli stessi, ma è anche vero che per danni particolari si innescano anche processi rigenerativi particolari.

Rimanendo noi ora un po’ sul generale, diciamo che nell’arco di minuti post-danno si vanno ad attivare alcuni segnali che non prevedono sintesi di proteine, ma sono segnali che prescindono da trascrizione e traduzione che sarebbero processi lunghi. Sono quindi segnali prodotti e rilasciati nell’immediato. Dopodiché, in risposta a questi fattori che scatenano la rigenerazione si attiveranno tutta una serie di tipi cellulari, ognuno dei quali deputati a alcune risposte specifiche.

Questi fattori sono rilasciati dalle cellule danneggiate lisate perché sono nel citosol di queste cellule e vanno sicuramente inserite le DAMPs, ovvero le Damage Associated Molecular Patterns. Ci sono anche dei fattori che invece sono rilasciati da cellule che sono stressate ma non ancora lisate, come i ROS o anche l’ATP.

Dettagli sui DAMPs e ROS

Nello specifico, i DAMPs sono delle molecole con una loro funzione vitale per le cellule quando vi sono all’interno, ma quando sono rilasciati dopo la lisi cellulare attivano tutta una serie di messaggi che sono recepiti dalle cellule vicine e sono sia del sistema immunitario, cellule infiammatorie, fibroblasti o cellule epiteliali o endoteliali. Tutte le cellule quindi di un tessuto o organo percepiscono il segnale delle DAMPs e quindi si attivano.

Oltre che nelle cellule e rilasciate dopo la lisi, le DAMPs sono anche nella matrice plasmatica. Quindi, per esempio, nei tubuli renali quando si ha un danno d’organo accade che le cellule residenti rilasciano delle proteine, le metalloproteasi, e le ialuronidasi che agiscono sulle componenti della matrice extracellulare liberando alcuni DAMPs, che non sono allora rilasciati per morte cellulare, ma sono liberati per attivazione delle metalloproteasi. Poi le DAMPs attiveranno le cellule mononucleate e vanno anche a favorire la sintesi de novo di altre DAMPs.

Stress meccanico e potenziale epiteliale

Altro stress senza sintetizzare proteine sono i flussi di calcio. Sono sempre dei segnali intracellulari, sono di fatto delle "onde di calcio" che si propagano in pochi secondi da una cellula all’altra di un tessuto. Allora, come è possibile che un segnale intracellulare di calcio dica alle cellule vicine di attivarsi e non dica altro? Infatti, è un tipo di signaling estremamente diffuso, ma in realtà non si sa bene ancora come questa onda di calcio voglia dire solo questo. Si pensa che possa dipendere dall'intensità del flusso di calcio, oppure possa dipendere una differenza spazio-temporale che fa attivare solo le cellule vicine in questo modo.

In ogni caso, il flusso di calcio attiva la sintesi dei ROS, ovvero le specie reattive dell’ossigeno. Questi ROS li abbiamo sempre pensati come nemici, ma in realtà sono anche detti nei processi rigenerativi come amici inaspettati, ovvero sono in grado di attivare anche risposte positive in una cellula. Intanto distinguiamo tra i ROS "buoni" quelli migliori. Molti dei ROS, soprattutto quelli ionici o radicali, hanno una vita talmente breve che non hanno modo di diffondere e comunicare a cellule distanti qualcosa, mentre il perossido di idrogeno è uno di quei ROS che, essendo a emivita lunga, formano un gradiente in un tessuto nello spazio intercellulare, mandando un segnale paracrino che attiva le cellule del sistema infiammatorio, va ad attivare le cellule endoteliali promuovendo angiogenesi e vanno anche ad operare un segnale attivatorio su cellule staminali e progenitrici residenti nei tessuti.

In questa lista allora di fattori della rigenerazione mettiamo anche lo stress meccanico. Infatti, le cellule possono rispondere anche a stimoli che non sono stimoli classicamente chimici, ma stimoli fisici, come la trazione, lo spazio in cui si trovano, la durezza della matrice e vi risponde a questi segnali. Allora, quando c’è un danno, pensiamo a una ferita o un taglio, esiste certamente uno stress meccanico percepito dalle cellule e alle quali rispondono.

Per un po’ di tempo si è pensato che lo stress meccanico causasse un signaling perché porta a creare uno spazio vuoto in vicinanza alle cellule che si attivano, ma in realtà se sperimentalmente su un monostrato cellulare adoperiamo una lesione rappresentativa di un taglio, e all’interno vi posizioniamo un blocco di agarosio, non si ha più attivazione della risposta rigenerativa. In seguito alla lesione creata infatti si attiva un qualche segnale, nella foto sotto si parla delle EGFR, ma se posiziono nella lesione qualcosa che fa sentire alle cellule la presenza di un ostacolo o qualcosa, non si ha più attivazione. Allora la conclusione è che il danno meccanismo viene percepito dalle cellule come mancanza di contenimento spaziale.

Infine, mettiamo anche la detenzione della perdita di integrità epiteliale sotto forma di potenziale elettrico. Infatti, così come nelle cellule esiste una differenza di potenziale tra intra ed extra cellulare, anche nei tessuti esiste un potenziale causato da diversi elettroliti, che si attesta a riposo a circa -70 mV che se volessimo descriverla nella sua direzione, diciamo essere perpendicolare all’epitelio. Ma nel caso di una ferita con perdita di integrità epiteliale, questa differenza di potenziale si perde e quello che accade è che si ripristina un equilibrio con un potenziale parallela e non perpendicolare all’epitelio.

Questo fenomeno fa sì che le cellule dell’epitelio ai bordi della ferita vadano a un processo di proliferazione e migrazione nel senso della differenza di potenziale, ovvero parallelo all’epitelio, attivandosi in direzione della ferita. È quindi una forma di chemiotassi ma non in risposta a uno stimolo chimico, ma a un potenziale e si parla di elettrotaxis o galvanotaxis.

Processi rigenerativi nei vertebrati

Fatto questo, innescato e attivato quindi tutti questi meccanismi di risposta al danno, c'è tutta una seconda fase che impiega giorni/ore/settimane in cui invece si prevede la sintesi proteica. I metodi rigenerativi possono essere distinti in due famiglie, ovvero epimorfosi o morfallassi, dove però i veri processi rigenerativi dei vertebrati rientrano sempre e solo nell’epimorfosi, ovvero che non è altro che una ricrescita di una parte dell’organismo,tessuto o organo, a partire da un tessuto non differenziato che prolifera e poi ridifferenzia riformando la struttura danneggiata. Nella morfallassi invece accade che le cellule residue dell’organismo si organizzano per riformare quell’organismo ma più piccolo, la differenza enorme sta allora nella presenza o assenza della fase proliferativa.

I processi di epimorfosi prevedono la presenza di un blastema, ovvero un tessuto indifferenziato. Infatti, la cosa primaria che accade per esempio nella formazione della coda di una lucertola è la formazione prima di un rivestimento (detto rivestimento ectodermico) del moncone di coda rimasto, e poi al di sotto di questo nuovo epitelio è la formazione di questo blastema, causato dalla perdita di differenziazione di cellule del tessuto osseo, muscolo scheletrico, cellule cartilaginee ecc., che creano un ammasso cellulare proliferante. Quando raggiunge la massa sufficiente numericamente, differenziano a formare tutti i tessuti richiesti, osso, cartilagine, muscolo ecc.

La formazione del blastema prevede questi processi di de-differenziazione di queste cellule di osso e muscolo, ma quando si dice de-differenziazione è una perdita dello stato differenziato delle cellule verso uno stato di meno-differenziamento. Ovvero, non diventano cellule germinali o staminali toti o pluri-potenti. Infatti, se una cellula muscolare de-differenzia possiamo comunque dire che quella è una cellula muscolare. Diversa invece è la trans-differenziazione per cui una cellula già differenziata switcha a una cellula diversa in differenziamento o passando da uno stato di cellula non differenziata, che potremmo chiamare progenitore, o in modo diretto.

Il blastema allora pertanto si forma con questa de-differenziazione di cellule differenziate, ma cosa curiosa e nota da secoli, è che è assolutamente necessario la presenza di fibre nervose alla formazione del blastema. Se infatti si denerva l’arto di una salamandra, per esempio, questo inibisce il processo rigenerativo.

Ipotesi neurotrofica e inibitoria

La domanda allora è perché questo accade? Secondo l’ipotesi neurotrofica, si pensa che le cellule nervose secernano mitogeni per far proliferare il blastema, quindi fattori pro-proliferativi. Oppure, al contrario, secondo l’ipotesi inibitoria, la denervazione fa rilasciare fattori inibitori dalle cellule di Shwann nel sito del danno che blocca la sintesi di blastoma. Sperimentalmente, l’ipotesi neurotrofica è quella che si è dimostrata più probabile, per cui le cellule nervose e le cellule di Shwann che circondano il nervo producono una serie di fattori, come EGFR2, o GDNF, IGF1, che agiscono sulle cellule del blastema e il cappuccio ectodermico che riveste il moncone.

Rigenerazione nei mammiferi: il caso del topo Acomys

Finora abbiamo visto rettili, ma vediamo i mammiferi. Infatti, mammiferi in cui si hanno processi rigenerativi della portata dell’arto della salamandra o la coda di una lucertola non avviene, se non in un topo particolare, chiamato topo Acomys o topo spinoso, che è capace di fare autotomia della cute, ovvero stesso identico fenomeno della coda della lucertola. Per questo è stato un modello molto studiato per capire come un mammifero sa fare certe cose. È così bravo Acomys che non solo rigenera la cute, ma rigenera il rene, il midollo spinale, il cuore, tante cose.

Cosa fa allora di diverso Acomys rispetto al classico topo che non fa rigenerazione? Diciamo che gli aspetti in cui i due topi sono diversi sono essenzialmente l’ambito della risposta immunitaria che mettono in atto e il tipo di matrice extracellulare che compone i tessuti. Infatti, in Acomys, la matrice extracellulare prodotta durante il processo riparativo è molto più ricca di collageno di tipo 3 rispetto alla matrice prodotta nel topo normale e questo rende conto di una enorme differenza meccanica nel tessuto di Acomys rispetto al topo normale, Acomys ha infatti tessuti più soffici.

Dal punto di vista invece immunitario si vede che a livello della ferita in Acomys non ci sono mai macrofagi M1, che sono quelli più pro-infiammatori che ci sono, rispetto ai macrofagi M2, che sono pro-rigenerativi. Il topo normale invece ha un processo infiammatorio spiccato di rilascio di chemochine e citochine infiammatorie maggiori e di maggior presenza di macrofagi M1.

Processi rigenerativi in altri animali mammiferi

Allora chiediamoci se esistono processi rigenerativi anche in altri animali mammiferi? La punta delle dita, ovvero la digital tip, è un esempio di rigenerazione che avviene anche in casi molto rari nell’uomo, o cane o gatto. La precondizione affinché avvenga la rigenerazione dell’estremità della falange è che il danno o la ferita avvenga salvaguardando lo strato germinativo dell’unghia, la porzione di unghia da cui l’unghia stessa si forma.

A seguito infatti dell’amputazione della falange avviene molto simile come per la salamandra o lucertola, ovvero formazione del blastema, sempre anche con il rivestimento ectodermico. E questo blastema è stato visto essere formato da cellule eterogenee e non sono cellule tutte uguali, ma ci sono cellule con diversa predisposizione a formare il muscolo piuttosto che osso, cartilagine ecc. Tra le cellule che formano il blastema nella rigenerazione della falange troveremo cellule che si sono de-differenziate, ma anche cellule staminali tessuto specifiche.

E da queste cellule staminali che partecipano a rigenerare la falange ricordiamo le LGR-6 positive, che appartengono al pathway Wnt/β-catenina, che rendono la rigenerazione di unghia e falange più efficiente. A conferma che molto spesso i meccanismi rigenerativi hanno caratteristiche comuni tra organi o organismi diversi, anche per questa rigenerazione di unghia e falange sono necessarie le cellule nervose, e tra i fattori prodotti sono la oncostatina M e il PDGF-AA.

In realtà, non ci sono solo precursori delle cellule di Shwann ma anche precursori di cellule mesenchimali intorno alle terminazioni nervose che producono matrice e fattori pro-rigenerativi. Non è allora un caso se le terminazioni nervose le troviamo nelle nicchie staminali, dove la denervazione locale di queste nicchie causa alterazioni della funzione staminale.

Connessione tra rigenerazione e tumori

Da notare che da questo argomento ci colleghiamo strettamente ai tumori, per cui si dice che sono come dei processi rigenerativi che non finiscono mai e la presenza di terminazioni nervose è uno di questi aspetti in comune. Il blastema infatti ricorda un po’ il tumore, con diverso solo il fatto che la proliferazione del blastema nel tempo e nello spazio è seguito da un differenziamento, mentre nel tumore sono cellule che proliferano e basta senza mai differenziare di fatto.

È noto ormai da evidenze sperimentali che le cellule del sistema nervoso hanno un effetto sulle cellule tumorali di tipo pro-proliferativo per lo più. Per tanto tempo si è pensato che le fibre nervose in un tumore che causano anche dolore della massa tumorale fosse poi soltanto legato alla capacità di certi tumori di metastatizzare, ovvero le cellule nervose sono usate dal tumore mediante invasione peri-neurale per migrare e metastatizzare.

Ma in realtà oltre a questo è anche vero che le cellule nervose producono fattori che sono trofici per le cellule tumorali, ovvero ne causano proliferazione. Immaginiamoci una terminazione nervosa, produce neurotrasmettitori per cui ci sono recettori sulle cellule tumorali, vascolari e su cellule del sistema immunitario. Allora succede che questi neurotrasmettitori inducano angiogenesi, agisce su macrofagi e cellule T del sistema immunitario attivandoli, ma anche sulle cellule tumorali e stromali causandone proliferazione.

È stato infatti dimostrato che se si va a denervare un tumore, si riduce di molto la proliferazione e la metastasi, ma ci ricorda allora il blastema per cui se denerviamo il moncone questo non fa crescere il blastema, allora è simile al tumore, per cui esiste una dipendenza del tumore dalle cellule nervose. Il sistema parasimpatico è un caso particolare perché in alcuni casi non solo fa crescere il tumore ma ha anche la funzione opposta, ovvero lo blocca.