Biologia animale e vegetale

DNA: sede dell’informazione genetica

Dogma centrale della biologia

Per quelle che sono le condizioni sulla vita adesso, la molecola depositaria dell’informazione genetica è il DNA. Il mondo non nasce come una molecola di DNA, ma con molecole di RNA, una molecola più reattiva da un punto di vista enzimatico. Il DNA, invece, è una molecola estremamente dinamica, in grado di portare avanti il dogma centrale della biologia, l’unica molecola esistente sulla terra che permette alle cellule eucariote e procariote di auto-replicarsi (dogma vale solo per le strutture cellulari).

L’informazione genetica è depositata in una molecola di DNA a doppia elica, che per le condizioni attuali, è l’unica molecola in grado di auto-replicarsi.

Quando il DNA deve produrre una struttura cellulare o una molecola funzionale, l’informazione genetica viene trasmessa all’RNA, con un meccanismo chiamato trascrizione. Queste molecole di RNA verranno tradotte al livello dei ribosomi per formare le proteine.

La quantità di DNA in un essere vivente è costante e variabile tra le diverse specie, anche se ci sono delle eccezioni. Per esempio, quando produciamo i gameti, spermatozoi e cellula uovo, il DNA in queste cellule è esattamente la metà rispetto a quello che trovo nel resto dell’organismo.

Il DNA è soggetto, nonostante la sua stabilità, a cambiamenti, poiché le sequenze di nucleotidi possono cambiare. Non sempre la mutazione del DNA provoca patologie negative.

Quando una cellula si prepara a produrre cellule figlie, la prima cosa che deve necessariamente replicare è il suo DNA. Se una cellula ha il DNA danneggiato e i meccanismi di monitoraggio dei danni funzionano bene all’interno della cellula, la cellula non si divide.

Johan Friedrich Miescher, biologo svizzero, isolò per la prima volta gli acidi nucleici. Alla fine del 1800 i ricercatori iniziarono a capire l’esistenza di un materiale fortemente acido presente in tutti i nuclei delle cellule che venivano osservate, una costante in tutte le strutture cellulari. Miescher isolò questo materiale e capì la composizione, cioè che questa acidità era dovuta alla grande abbondanza di gruppi fosfato. Siccome questo materiale veniva isolato all’interno del nucleo delle cellule osservate, venne chiamato nucleina, poiché il biologo non aveva la consapevolezza di aver isolato il DNA.

Esperimenti che dimostrano che il DNA è la molecola depositaria dell’informazione genetica

Esperimento Griffith

Griffith studiava una patologia che affliggeva molti uomini in quel periodo e che causava molte morti, ossia la polmonite. In particolare, si dedicava alla polmonite causata dal batterio Streptococcus pneumoniae, il quale poteva esistere in due forme: colonie con un aspetto liscio o ruvido. Andando ad analizzare chimicamente queste differenze, si rende conto che le due forme in cui poteva esistere il batterio si differenziavano perché una produceva la capsula (colonia liscia), l’altra no (colonia rugosa).

La capsula serve per l’adesione, è fatta principalmente da polisaccaridi e proteine, è la struttura che riveste la parete fatta da peptidoglicano e che dà un aspetto appiccicoso al batterio liscio, permettendogli di aderire alle pareti che vuole infettare. Per questo il batterio liscio è quello virulento.

Se, in laboratorio, il batterio liscio fosse stato iniettato all’interno di un topo, questo sarebbe morto.

La forma rugosa, invece, forma batterio che non produce la capsula, non è virulento, è proprio l’aspetto rugoso che gli impedisce di infettare il topo, poiché se entra all’interno dell’organismo viene riconosciuto dai fagociti che lo mangiano per fagocitosi e lo distruggono con i lisosomi.

Il ricercatore cercò di capire da cosa dipendesse questa differenza, forma liscia e forma rugosa, quindi fece diversi esperimenti. Provò ad uccidere i batteri virulenti con il calore, quindi li iniettò all’interno del topino, e i batteri morirono. Quando venivano uccisi i batteri lisci e il residuo veniva incubato per un certo lasso di tempo con le cellule batteriche rugose, la miscela veniva iniettata all’interno del topo e vide che i batteri erano in grado di indurre in alcuni topi la malattia e la morte.

Dunque, quando era avvenuta l’incubazione del batterio patogeno morto con quello vivo non patogeno, doveva essere successo qualcosa a livello molecolare che ha indotto il batterio non patogeno a trasformarsi in quello virulento, cioè ad acquisire la capacità di produrre la capsula.

Siccome queste molecole trasformavano il batterio non virulento in virulento, questa molecola, di cui ancora non si sapeva la composizione chimica, veniva chiamata principio trasformante.

Ha scelto di utilizzare i batteri perché hanno la capacità di prendere facilmente il materiale genetico presente nell’ambiente esterno.

Griffith è riuscito a capire l’esistenza di una molecola in grado di cambiare le proprietà chimiche di una cellula, usando i batteri.

Esperimento di Avery, Macleod e McCarthy

Loro rifecero lo stesso esperimento di Griffith, presero i batteri non patogeni e andarono a incubarli con il residuo ottenuto dall’uccisione del batterio patogeno. La differenza tra questi due esperimenti era che Griffith prese tutta la miscela (batterio non patogeno e residuo batterio patogeno), mentre questi tre ricercatori trattarono questa miscela eterogenea di molecole del batterio ucciso separando le classi delle macromolecole. Partendo da questa miscela fecero dei trattamenti chimici in modo da selezionare soltanto RNA, DNA e proteine.

La intuizione dei ricercatori era se il materiale genetico fosse depositato nelle proteine o nel DNA (per questo i lipidi furono scartati); la comunità scientifica faceva il tifo per le proteine perché avevano un sacco di funzioni.

Questi tre ricercatori dimostrarono, invece, che era il DNA il principio trasformante di Griffith.

Come prima prova gli scienziati uccisero il batterio patogeno, andarono a trattare questa miscela con un enzima chiamato RNasi, che serviva per rompere i legami fosfodiesterici del RNA ed eliminare tutte le molecole di RNA.

Misero poi la miscela in contatto con i batteri non patogeni e poi la iniettarono all’interno del topo, i batteri diventavano lo stesso virulenti. Quindi videro che anche se avevano eliminato RNA la trasformazione c’era, capirono allora che RNA non era il principio trasformante.

Successivamente presero una provetta e trattarono la miscela di batteri morti con enzimi chiamati proteasi, rompendo così il legame peptidico. La miscela era stata privata dalle proteine, ma i batteri si trasformavano lo stesso; quindi, nemmeno le proteine erano il principio trasformante.

Soltanto quando trattarono la provetta con la DNasi, enzimi in grado di idrolizzare legami fosfodiesterici del DNA, i batteri non si trasformavano. In conclusione, dimostrarono che il principio trasformante è il DNA.

Quando i risultati di questo esperimento furono pubblicati, non furono presi in considerazione dalla comunità scientifica, che continuò a pensare che il principio trasformante fosse la proteina.

Esperimento di Hershey e Chase

Soltanto 10 anni più tardi si ebbe la dimostrazione che il DNA potesse essere la molecola depositaria dell’informazione genetica grazie a questi due scienziati. Loro scelsero come oggetto di studio i virus che infettavano in maniera specifica i batteri, come il batteriofago T2, poiché hanno come patrimonio genetico il DNA. I virus sono stati un ottimo modello, poiché le particelle virali, a differenza delle cellule, non hanno il dogma centrale della biologia; quindi, contengono al loro interno DNA o RNA. L’altro vantaggio del virus come modello è che è fatto soltanto da un involucro esterno proteico chiamato capside e internamente solo dal materiale genetico.

Il più grande vantaggio era dovuto al modo in cui i virus vanno ad infettare i batteri, ad esempio i batteriofagi hanno una forma particolare, ovvero si legano alla superficie del batterio e una volta aderito iniettano il DNA, mentre la parte proteica rimane fuori. Il DNA è sufficiente a riformare tutte le particelle virali. Ovviamente questi due scienziati avevano capito che entrava una sola delle due componenti, ma non sapevano quale e quali delle due fosse il principio trasformante.

Loro riuscirono a trovare il modo di distinguere le proteine dal DNA usando degli isotopi radioattivi, nel DNA utilizzarono il fosforo 32, che marca il DNA rendendolo tutto radioattivo; nelle proteine utilizzarono lo zolfo 35 (lo ritroviamo nella cisteina).

Fecero crescere i batteri in una soluzione liquida, in un terreno ricco di nutrienti, così i batteri si potevano dividere, e all’interno di questo contenitore metto una piccola quantità di particelle virali che cominciano la loro infezione. I virus si legano ai batteri utilizzando delle proteine presenti sulla parete del batterio con cui fanno interazioni deboli. A questo punto prendo la soluzione e la metto all’interno di un frullatore, lo aziono e tutto quello che era legato in maniera debole sulla superficie si stacca. Questo procedimento serve per separare quello che è entrato da quello che è rimasto fuori, perché devo capire quale delle due macromolecole dà l’infezione. La forza centrifuga porterà sul fondo della provetta quello che è più pesante ossia i batteri (precipitato), invece nella parte liquida i nutrienti e la parte del virus che non è entrata. Così andarono a separare la parte liquida e la parte solida e misurarono la radioattività, lo fecero sia nell’esperimento dove avevo marcato le proteine sia nell’esperimento dove avevo marcato il DNA.

In entrambi i casi c’era l’infezione, la produzione di particelle virali, ma soltanto in questo caso alcune colonie che venivano distrutte risultavano ancora radioattive, perché il DNA quando si replica conserva la molecola di partenza. Così dimostrarono che era il DNA ad entrare e che questo determinava la formazione di particelle virali. Sia nel primo esperimento che nel secondo si aveva la morte dei batteri, perché il DNA entra in entrambi i casi e uccide una parte delle colonie batteriche. La differenza è che nel secondo esperimento prima di uccidere le particelle virali si devono replicare, una parte del DNA replicato mantiene la radioattività presente nel DNA d’origine.

La composizione chimica del DNA

Il desossiribosio è uno zucchero pentoso, un anello a 5 atomi di carbonio, di cui 4 sono chiusi mentre il 5° lo troviamo fuori. Presenta dei gruppi ossidrili OH, di cui quello in posizione 1 si lega con legame covalente alla base azotata; nel caso del DNA OH in posizione 2 non c’è, ma è presente un atomo di idrogeno H; importantissimo è il 3’ che l’OH che è utilizzato, insieme all’altro gruppo funzionale, per formare il legame fosfodiesterico per i polinucleotidi.

La parte reattiva del nucleotide è 5’ che è legato a un gruppo fosfato, soprattutto il fosfato che troviamo in posizione alfa. Quando sono monomeri i nucleotidi hanno tre gruppi fosfato, ma per formare il legame covalente dell’acido nucleico, utilizzo sempre questo gruppo fosfato in posizione alfa, con una reazione di condensazione tra questo gruppo P e l’ossidrile dell’altro nucleotide.

L’ossidrile in posizione 2 in RNA, lo rende più reattivo, a differenza del DNA che non lo ha. Le basi possono essere purine, A e G, oppure pirimidine, C, T e U (al posto di T).

Quando vado a formare il legame covalente dell’acido nucleico le basi azotate non sono importanti, mentre gli zuccheri desossiribosio e il ribosio sì, poiché lo scheletro portante è dato da un’alternanza di zucchero e fosfato (il gruppo fosfato reagisce con l’ossidrile di un altro monomero).

Si crea un filamento asimmetrico: un’estremità con un nucleotide che ha libero 5’ fosfato e un’estremità che ha invece il 3’ alfa libero (gruppo P). Questo meccanismo detto di catalisi e vale sia per DNA che RNA.

Esperimento sulla composizione chimica del DNA

I chimici hanno iniziato a lavorare sul DNA (da Miescher nucleina) per capirne l’esatta composizione chimica. Avevano individuato un elemento costante, ossia lo zucchero, il fosfato che dava acidità e la presenza delle basi azotate.

Erwin Chargaff andò a studiare la composizione chimica del DNA che veniva estratto da vari tipi cellulari.

Appurato che i gruppi fosfato e gli zuccheri erano la parte costante, si chiese se c’era una regola nella quantità delle basi azotate all’interno del DNA. Quindi isolò le varie molecole di DNA e andò a contare la quantità di A, T, G e C (ovviamente i valori sono dati da vari esperimenti, quindi sono valori medi). Trovarono che A era uguale in quantità alla T, ovvero il numero di nucleotidi che contenevano queste basi era uguale, anche G era uguale a C, questo rapporto rimaneva costante. Si trattava di una regola che valeva per tutti gli esseri viventi. Capirono che la quantità di una purina è uguale alla quantità della sua pirimidina.

Fece altre indagini chimiche insieme ad altri ricercatori e pubblicarono una ricerca dove venivano elencate una serie di regole, riprese poi da Watson e Crick per stabilire che il DNA ha una struttura a doppia elica e che si può auto-replicare, perché è formato da due filamenti complementari.

Queste regole vengono chiamate ancora oggi “le regole di Chargaff”, sono:

• La composizione in basi del DNA varia da specie in specie.
• La composizione in basi del DNA di una certa specie non si modifica in base all’età, allo stato nutritivo o alle variazioni ambientali.
• Molecole di DNA isolate da tessuti diversi della stessa specie hanno la stessa composizione in basi.
• In tutte le molecole di DNA, indipendentemente dalla specie:
• Il numero di A è uguale al numero di T.
• Il numero di G è uguale al numero di C.
• La somma delle basi purine (A e G) è uguale alla somma delle basi pirimidine (T e C).

La struttura a doppia elica del DNA

La struttura a doppia elica è stata ottenuta grazie agli studi condotti da Chargaff sulle basi azotate, ma anche grazie a Rosalind Franklin, una ricercatrice che lavorava nel laboratorio di Maurice Wilkins, frequentato anche da Watson e Crick. Questa dottoranda stava lavorando sui cristalli del DNA, attraverso una tecnica chiamata cristallografia a raggi X, usata ancora oggi per studiare la struttura delle molecole.

Questa procedura permette, usando il cristallo di quella molecola e i raggi X, di ottenere una fotografia di come è la struttura tridimensionale della molecola. La fotografia che ottenne Franklin era caratteristica delle proteine che nello spazio si ripiegavano a elica. Da queste immagini si possono anche fare delle misure quantitative delle distanze fra i vari atomi, studiandole, infatti, questa scienziata riuscì a ottenere le misure caratteristiche della doppia elica del DNA, si capì che il diametro è sempre costante e vale 2 nm. Tale diametro suggeriva che lo scheletro di zuccheri e gruppi fosfato si trovasse nella parte esterna dell’elica e le basi azotate nella parte interna.

La capacità di formare una struttura ordinata, indipendentemente dalla molecola di DNA che veniva cristallizzata, cioè dalla fonte cellulare da cui veniva isolata, portò a ipotizzare che l’unica spiegazione per avere una doppia elica ordinata era che i due filamenti polinucleotidi potessero avere una disposizione antiparallela. Quindi, le regole di Chargaff permettono di capire che A si associa a T, mentre G a C, e le misure fatte con il cristallografo affermano che la doppia elica deve essere antiparallela e complementare.

Quando metto insieme basi non complementari il DNA ha una forma distorta; quindi, ogni purina si deve associare a una pirimidina.

Questi risultati furono ripresi da Watson e Crick, i quali costruirono il primo modello tridimensionale del DNA, ottenendo così il premio Nobel.

Nel 1953 si ha la pubblicazione della struttura del DNA, da cui partirono una serie di ricerche che nel 2001 hanno permesso di scoprire le sequenze del genoma umano.

Il DNA è costituito da 2 filamenti asimmetrici che hanno uno un’estremità 5’ e uno 3’, che si legano con disposizione antiparallela tra loro. I legami tra i nucleotidi in ciascuna catena sono legami fosfodiesterici covalenti, mentre quelli che uniscono i filamenti appaiati sono a H. La struttura tridimensionale è stabilizzata da legami a idrogeno, tre per A e T, 2 per G e C. Ad ogni giro d’elica si hanno 10 coppie di basi. L’elica ha avvolgimento destrogiro e presenta due solchi: uno maggiore e uno minore.

La denaturazione del DNA

La doppia elica è la forma più stabile del DNA, tanto che se vado a rompere i legami a idrogeno e a separare i due filamenti, spontaneamente i due filamenti si riconoscono e si riuniscono. Infatti, l’apertura della doppia elica richiede energia e si parla di denaturazione del DNA, perde la sua struttura tridimensionale e non funziona più. Ogni molecola di DNA ha la sua richiesta specifica di energia per potersi aprire completamente.

In laboratorio la separazione dei filamenti di DNA viene fatta con la temperatura, secondo vari studi c’è una forte dipendenza tra la temperatura, necessaria ad aprire il DNA, e la composizione in basi.

Per ogni molecola, studiando la sua composizione in basi, è stata determinata una temperatura, chiamata temperatura di fusione (Tm), alla quale il 50% delle molecole di quel tipo sono state denaturate.

Se io abbasso la temperatura sotto questo valore, spontaneamente il DNA si ricerca e si riunisce, ritornando ad essere una molecola funzionante. Il DNA riesce a rinaturarsi, ma