Biochimica generale - 2° parziale

Biologia molecolare

I protagonisti della biologia molecolare sono i nucleotidi, come gli amminoacidi per le proteine.

I nucleotidi sono costituiti da una base azotata che forma un legame di tipo glicosidico con uno zucchero pentoso, gruppo fosfato, ribosio o deossiribosio.

Le basi azotate sono derivati di due precursori, la pirimidina e la purina.

Tra le purine ci sono adenina e guanina.

Tra le pirimidine ci sono citosina, timina e uracile (RNA).

L’unità fondamentale è il ribosio per RNA e il deossiribosio per DNA.

Si trovano nella forma beta-furanosica.

Numerazione

Per convenzione gli atomi delle basi azotate sono numeri e gli atomi degli zuccheri sono numeri primi.

La base azotata è legata allo zucchero tramite un legame N-beta-glicosidico.

Il legame è in 1’ dello zucchero con l’atomo in 9 della purina o l’atomo in 1 della pirimidina.

La base azotata più lo zucchero costituisce il nucleoside = nucleotide senza gruppo fosfato.

Metilazioni

Nel DNA alcune basi possono essere modificate attraverso delle metilazioni.

Quindi nel DNA abbiamo anche:

Questa metilazione conferisce alla frequenza di DNA in cui è introdotta delle proprietà particolari.

Una metilazione può portare a una variazione dell’espressione genica della sequenza in cui è coinvolta la metilazione, ad esempio può accendere o spegnere un segnale di trascrizione.

Legami fosfodiesteri

I diversi nucleotidi a livello degli acidi nucleici si legano attraverso dei legami fosfodiesteri.

Questo legame si instaura tra l’ossidrile in 3’ dello zucchero presente nel primo nucleotide e tra l’ossidrile in 5’ dello zucchero di un nucleotide successivo.

Il gruppo fosfato quindi fa due legami esteri.

Lo scheletro degli acidi nucleici è costituito da un'alternanza di gruppi fosforici e di residui di pentosio, mentre le basi azotate possono essere considerate come gruppi laterali uniti allo scheletro a intervalli regolari.

Si ha una direzionalità data dal fatto che il DNA è sintetizzato in direzione 5’-3’.

Quindi:

• L’estremità 5’ è al primo nucleotide.
• L’estremità 3’ è all’ultimo nucleotide.

Si utilizzano lettere per indicare le basi azotate.

Questa convenzione è importante per le banche dati genomiche.

Scrivere saper struttura peptide di un.

Scoperte sul DNA: Chargaff

Negli anni ‘50 il gruppo di ricerca di Chargaff ha scoperto che:

• Le composizioni in basi del DNA sono caratteristiche per ogni specie.
• Le molecole di DNA estratte da cellule diverse di uno stesso organismo hanno la stessa composizione in basi, quindi ad esempio le foglie e radice di una stessa pianta hanno la stessa composizione.
• La composizione in basi non si modifica, né con l’età, né con lo stato nutrizionale, né con la variazione dell’ambiente.
• A = T.
• In tutte le molecole, il numero di adenine era uguale al numero delle timine, e il numero delle citosine era uguale al numero di guanine: G = C.

Queste scoperte sono state molto importanti per capire la struttura del DNA.

Cristallografia a raggi X

Cristallografia a raggi X: engine~cristallografia ai raggi X.

La cristallografia ai raggi X ha contribuito a rivelare la struttura del DNA.

La cristallografia effettuata da Rosalind Franklin ha permesso ai ricercatori di comprendere la struttura elicoidale del DNA.

La posizione degli atomi in una sostanza chimica cristallizzata può essere determinata in base al quadro di diffrazione dei raggi X che l’hanno attraversata.

Il quadro del DNA è estremamente regolare e ripetitivo.

Da questa immagine si è visto che la molecola è elicoidale (croce) e ripetitiva (3,4 Angstrom si ripete ogni 34 Angstrom).

Watson e Crick ipotizzarono che la forma del DNA era una doppia elica, ma non aveva avuto nessuna prova, e grazie a Rosalind Franklin riuscivano a capirlo.

Loro ipotizzarono che la catena degli zuccheri e fosfati si trovano nella parte esterna e le basi azotate si vanno ad appigliare a due a due formando dei legami a idrogeno.

Struttura del DNA di Watson e Crick

Le due catene formano una doppia elica.

All’esterno dell’elica ci sono delle catene costituite dall’alternanza di zucchero e fosfato.

All’interno dell’elica ci sono le basi azotate che instaurano tra loro dei legami a idrogeno e stabilizzano i collegamenti tra le due eliche.

C’è l’appaiamento della timina con adenina e citosina con guanina.

Per avere una struttura regolare e ordinata è necessario che le due catene di nucleotidi corrano in direzione opposta, quindi una catena 3’-5’ e l’altra 5’-3’.

Infatti le due catene sono antiparallele.

All’interno della struttura ci sono delle scanalature che sono alternante e di dimensioni differenti, cioè una scanalatura maggiore che è più ampia e una minore più piccola.

La struttura di un giro dell’elica completo consiste con una scanalatura maggiore e una minore ed è alta 3,4Å, all’interno di questa scanalatura ci sono 10 basi sovrapposte, ognuna ruotata rispetto all’altra di 36°.

Il solco maggiore serve come sito di interazione di proteine che legano il DNA.

Quindi per questo c’è questa differenza.

B.

Questa è la struttura del DNA proposta da Watson e Crick.

È destrorso.

P ZP ZP Z.

Caratteristiche della struttura a doppia elica

Ci sono legami che si instaurano tra le diverse basi azotate.

Ci sono due legami a idrogeno tra adenina e timina, quindi questo legame è più debole.

Ci sono tre legami a idrogeno tra guanina e citosina.

Ci sono proprio questi appaiamenti perché permettono di ottenere una struttura che ha una dimensione regolare = l’uno è lungo 11,1Å e l’altro è 10,8Å, quindi hanno dimensioni simili.

Se invece si mischiano le basi si ottengono dei legami a idrogeno che farebbero distorcere la struttura.

Rispetto all’asse immaginario della doppia elica, le basi azotate sono perpendicolari all’asse centrale, invece gli zuccheri e fosfati sono paralleli.

Le basi adiacenti distano tra loro di 3,4Å.

Ogni base ruota da quella precedente di 36°.

Ci sono 10 basi ogni giro dell’elica.

Oltre ai legami a idrogeno, la doppia elica è altamente stabilizzata dalla presenza di interazioni di Van der Waals tra le basi azotate adiacenti.

Tipologie di DNA

• Forma A = può essere riscontrata in campioni di DNA disidratati oppure quando si ha dei ibridi di DNA-RNA.
• Forma Z = può essere presente in natura, soprattutto in corrispondenza di una sequenza alternata di purine-pirimidine.
• Forma B = è quella più comune.

Caratteristiche chimico-fisiche della doppia elica del DNA

Come le proteine, il DNA può naturarsi e denaturarsi.

Se si fornisce calore all’elica del DNA si ha la denaturazione del DNA, con la separazione dei due filamenti.

Dopo che la sorgente di calore viene rimossa, la doppia elica si riforma e si ha un processo di rinaturazione.

Si denatura reversibilmente.

Curva di melting del DNA

Questa curva è possibile studiarla tramite delle tecniche spettroscopiche.

Durante il processo di denaturazione del DNA si ha un cambio dell’assorbimento della doppia elica, rispetto a quando è unita.

Si ottiene una curva a sigmoide, come quella proteine.

La Tm è la temperatura alla quale si ha lo srotolamento della doppia elica.

Essendo una curva a sigmoide si capisce che è un processo cooperativo.

La Tm dipende dal numero di T e A e C e G, perché tra una è tre e l’altra è due legami a idrogeno. La quantità di calore per denaturare tre legami a idrogeno è maggiore.

La Tm dipende anche dalla forza ionica della soluzione: maggiore è la forza ionica, cioè la concentrazione salina, e più alta è la temperatura di melting, perché le cariche negative dei gruppi fosforici sono protette dai cationi in soluzione e quindi c’è una maggiore stabilizzazione della doppia elica.

Acidi nucleici

Si dividono in DNA e RNA.

Il DNA è organizzato all’interno delle cellule in cromosomi.

Nelle cellule procariote c’è un unico cromosoma.

Nelle cellule eucariote i cromosomi sono all’interno del nucleo.

La quantità di DNA che si può trovare all’interno di una cellula cambia in base al tipo di cellule, aumentando la complessità dell’organismo aumenta anche il numero delle basi.

Esempio Escherichia coli

Il cromosoma di Escherichia coli è lungo 1,7 nm e si trova all’interno di una cellula di 2 micro.

Ogni cellula eucariota si ha 2 m di DNA. Un corpo adulto umano contiene 10¹⁴ cellule che corrisponde a 2X10¹¹ Km (1,5X10⁸ Km distanza tra sole e terra).

Composizione del DNA negli eucarioti

I genomi degli eucarioti hanno una densità genica ridotta.

La densità genetica è la quantità di geni all’interno di una determinata sequenza.

Quando l’organismo aumenta di complessità, all’interno dello stesso numero di basi si ha una densità genica che si riduce via via.

In media nell’uomo la quantità di DNA che codifica le proteine rappresenta solo 2-4% dell’interno genoma.

Oltre alle regioni codificanti, nel DNA si trovano anche delle sequenze introniche, delle sequenze ripetute, delle sequenze intergeniche.

Negli eucarioti, il 98,5% sono delle sequenze che non codificano.

Le sequenze che codificano sono solo 1%.

L’organizzazione e il contenuto del genoma umano

Sequenze ripetute.

Corrispondono al 54% del DNA.

Ci sono frequenze altamente ripetitive che non vengono mai trascritte.

Ci sono frequenze moderatamente ripetitive che codificano per delle RNA che sono presenti in alte concentrazioni, che sono RNA-transfer e RNA-ribosomiale.

Ci sono i trasposoni, che sono delle sequenze mobili che hanno la capacità di spostarsi all’interno del genoma. Se questi trasposoni si inseriscono in posti particolari possono portare a patologie.

Ci sono trasposoni a DNA e retrotrasposoni.

I trasposoni sono il 45% del DNA.

Possono derivare da infezioni virali di retrovirus acquisite dai nostri antenati.

Il trasferimento dei trasposoni può avvenire in due tipi:

• Il trasposone viene tagliato dal suo punto di origine e viene trasferito da un’altra parte.
• Il trasposone può essere spostato dopo che viene duplicato, e poi può essere trasferito in un altro sito.

Quindi può avvenire con o senza duplicazione.

Esempio dell’attivazione dei trasposoni: cariossidi del mais

I genomi delle piante sono molto ricchi di trasposoni.

La trasposizione causa una variazione della pigmentazione.

Nel 1940 Barbara McClintock (Nobel per la Medicina nel 1983) scoprì gli “elementi di controllo” nel mais. I trasposoni sono alcuni elementi genetici presenti nei cromosomi capaci durante lo sviluppo di spostarsi da una posizione all'altra del genoma.

La diversa colorazione delle cariossidi del mais è il risultato dell'azione dei trasposoni.

I trasposoni, che vennero individuati inizialmente studiando i chicchi del mais, sono presenti in tutti gli esseri viventi, sia in quelli più sviluppati, come l'uomo, sia nei batteri.

Tutto ciò avviene in maniera casuale.

Ipotesi sull'origine e la funzione del DNA non codificante

• Rimasugli di pseudogeni, che nel corso dell'evoluzione hanno perso la loro funzione, anche a causa di eventuali frammentazioni della sequenza codificante.
• Il DNA non codificante ha una funzione protettiva nei confronti delle regioni codificanti. Dal momento che il DNA è continuamente esposto a danni casuali da parte di agenti esterni, c’è meno probabilità.
• Il DNA non codificante è una sorta di riserva di sequenze al momento non codificate, ma dalle quali potrebbe emergere un qualche gene in grado di conferire vantaggio all'organismo.
• Parte del DNA non codificante è ritenuto essere, più semplicemente, un elemento spaziatore tra geni.
• Alcune regioni di DNA non codificante hanno una funzione regolatoria, controllano l'espressione di alcuni geni o lo sviluppo di un organismo dallo stato embrionale a quello adulto.

Organizzazione del DNA

C’è una organizzazione sofisticata in modo tale che tutte le molecole di DNA riescono a essere insieme all’interno del nucleo.

Il telomero serve per stabilizzare il cromosoma e viene prodotto dalle telomerasi.

Il centromero serve durante il processo di divisione cellulare.

Tra queste due zone ci sono le sequenze uniche che costituiscono i geni.

Sono entrambi zone costituite da sequenze ripetute.

Ci sono i punti dove origina il processo di replicazione, numerose negli eucarioti.

Il DNA essendo molto lungo ha un compattamento ben preciso.

Superavvolgimenti

Ci sono i superavvolgimenti che possono essere rappresentati come il filo di un telefono.

Si ha prima un avvolgimento dato dal filo del telefono e poi questo filo si superavvolge.

Alcuni ricercatori hanno visto che il DNA circolare quando è superavvolto occupa uno spazio minore.

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Con il superavvolgimento si crea anche una tensione strutturale, perché se il DNA è rilassato sarebbe lineare.

Il superavvolgimento si ha solo quando si ha una superficie chiusa.

Anche se il DNA è lineare ma è talmente lungo che si comporta come se fosse una superficie chiusa.

Il primo livello di avvolgimento è dato dalla doppia elica.

Il secondo livello di avvolgimento è dato dal superavvolgimento.

Due tipi di superavvolgimenti: negativi o positivi

Il DNA può andare incontro a superavvolgimenti che possono essere negativi o positivi.

I superavvolgimenti negativi sono quelli che fanno ruotare il DNA attorno al suo asse in direzione sinistrorsa e favoriscono l’apertura della doppia elica, ad esempio durante la replicazione che bisogna aprire la doppia elica del DNA, visto che il DNA ha andamento destrorso.

I superavvolgimenti positivi il DNA ruota in direzione destrorsa e questo causa un superriavvolgimento perché seguono la direzione dell’avvolgimento del DNA.

Tutto ciò avviene se il filo viene mantenuto a una estremità fermo.

I superavvolgimenti del DNA avvengono quando il DNA è sottoposto a una deformazione strutturale, ad esempio quando durante la replicazione in cui la doppia elica viene separata.

Il numero totale degli avvolgimenti rimane costante, perché se si apre la doppia elica si formerà un superavvolgimento più avanti, a meno che non si rompono uno dei due filamenti.

Topologia

La topologia è una delle più importanti branche della matematica moderna. Si caratterizza come lo studio delle proprietà delle figure e delle forme che non cambiano quando viene effettuata una deformazione senza "strappi", "sovrapposizioni" o "incollature".

La topologia permette anche di studiare il numero di legame topologico del DNA.

Il numero di legame topologico è il numero di volte che un filamento deve essere passato attraverso l’altro affinché le due catene possano separarsi l’una dall’altra (LK = linking number).

Questo numero è dato dalla somma di due componenti geometriche, il twist e il writhe.

Il twist è l’avvolgimento, cioè il numero di volte che un filamento deve girare intorno all’altro (nel DNA B è di 10,5).

Il numero di writhe sono i superavvolgimenti, cioè è la torsione che è il numero di incroci dell’asse longitudinale su se stesso e /o il numero di spirali nel DNA.

Il numero di legame topologico LK rimane costante se non si ha rotture.

Il writhe può essere plectonemico o a solenoide.

• Di natura plectonemica = in cui l’asse longitudinale della doppia elica è avvolto su se stesso, ed è caratteristico per le piccole molecole di DNA.
• Di natura a solenoide = in cui l’asse longitudinale della doppia elica è avvolto come attorno un cilindro, ed è caratteristico del DNA dei cromosomi.

Topoisomerasi

Regolazione del superavvolgimento = altamente regolato.

Il superavvolgimento è un processo che.

Ci sono degli enzimi che hanno il compito di aumentare o diminuire il grado di disavvolgimento, non essendo il DNA una struttura immobile.

Questi enzimi si chiamano topoisomerasi e servono per aumentare o diminuire il grado di avvolgimento del DNA, rilassano il DNA.

Due tipi di topoisomerasi: AUMENTALE.

• Topoisomerasi di tipo I = si ha la rottura di un’unica catena di DNA.
• Topoisomerasi di tipo II = si ha la rottura di entrambe la catene di DNA e si utilizza ATP.

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Esiste anche una particolare topoisomerasi batterica di tipo II che invece che rilassare il DNA, aumentano il suo avvolgimento.

Come funziona la topoisomerasi di tipo I

Si ha una proteina che può esistere in una conformazione chiusa o aperta.

Nella conformazione chiusa c’è una tirosina reattiva che fa un attacco sul legame fosfodiestereo di un filamento di DNA, e crea un legame covalente tra l’OH della tirosina e il fosfato. Questo provoca la rottura del legame fosfodiestereo del DNA.

Ⓒ ②.

ⒸⒶ.

Questo legame comporta una modifica conformazionale e permette il passaggio del filamento intatto attraverso il taglio 5.

Ora si ha la reazione contraria, quindi l’OH fa un attacco Nu e si ha la riformazione del legame fosfodiestereo, e si riunisce il filamento di DNA che era stato tagliato.

Quindi lo rompe, la proteina cambia la conformazione e si apre, permette il passaggio dell’altro filamento intatto e poi si richiude.

È un processo che non serve ATP e si aumenta l’avvolgimento.