Biochimica generale - 1° parziale

Amminoacidi e proteine

La biochimica si basa sull'alfabeto degli amminoacidi.

Vengono rappresentati e sono caratterizzati dalla presenza di un gruppo carbossilico (acido) e amminico (basico).

Nelle proteine sono tutti alfa-amminoacidi, cioè il gruppo carbossilico e amminico sono posizionati sullo stesso carbonio (C alfa) ↑.

Si ha un protone H. Si ha una catena laterale R che è diversa in base al tipo di amminoacido.

Gli amminoacidi presenti nelle proteine sono 20.

Si dividono in due grosse categorie in funzione della loro catena laterale R: polari e apolari.

Ci sono amminoacidi:

• Polari = ci sono neutri, carichi neg (amminoacidi acidi) e pos (amminoacidi basici).
• Apolari = anelli aromatici pVind: associanos strutturestabilcreareloro pertra7amminoacidi:20 -insolubili idrofobici = acqua in.

Amminoacidi con R alifatici, non polari

• Glicina = più semplice. Sulla catena è presente solo un H, quindi sarà poco ingombrante, e rende il carbonio in alfa non chirale.
• Alanina = la R è un gruppo metilico.
• Valina = amminoacido ramificato, la R è isopropile.
• Leucina = ramificato, la R è un isobutile (aggiungo CH2).
• Isoleucina = ramificato, la R è un sec-butile.
• Metionina = la R contiene un atomo di S. Durante la sintesi proteica è l’amminoacido iniziale. È facilmente ossidabile (problema).
• Prolina = la R è una catena pirrolidinica e quindi il gruppo amminico è intrappolato all’interno di una struttura ad anello, e perciò sarà molto rigida come catena laterale.

av=Rofici -.

Amminoacidi con R polari, non carichi

• Serina = la R ha un gruppo ossidrilico e può essere facilmente modificata attraverso fosforillazioni.
• Treonina = la R ha un gruppo ossidrilico che può essere fosforilizzato.
• Asparagina = la R ha un gruppo ammidico neutro.
• Glutammina = ha una CH2 in più rispetto alla asparagina.
• Cisteina = la R ha un gruppo tiolico e forma dei legami covalenti con altre cisteina e forma la tramite dei cistina ponti disolfuro. Cistina.

Tendono ad ossidarsi e va a formare dei ponti di solfuro.

La polarità è dovuta ai gruppi ossidrilici, ai gruppi ammidici, e al gruppo sulfidrilico.

Insulina e ponti di solfuro

Insulina, anche lei contiene dei ponti di solfuro.

È un ormone che regola il metabolismo del glucosio e lipidico, e ha funzioni a livello trascrizionale.

È una proteina costituita da due catene polipeptidiche: A e B.

All’interno delle catene ci sono dei ponti di solfuro.

Ce ne sono due tipi: intracatena (amm 6 e 9), e due catene intercatena (tengono insieme la catena A e B).

Quindi i ponti disolfuro sono fondamentali per stabilizzare le proteine e si devono formare tra le cisteine in modo corretto.

Gruppo carbossilico agisce come acido: dona un H.

Amminoacidi con R carichi negativamente

(Non dico “acidi” perché a pH fisiologico sono carichi negativamente).

• Aspartato.
• Glutammato.

Gruppo amminico agisce come base perché accetta un H.

Amminoacidi con R carichi positivamente

• Lisina.
• Arginina = la R ha un gruppo guanidinico.
• Istidina = la R ha un imidazolo, a pH fisiologico può passare alla sua forma protonata per piccole variazioni di pH che si possono manifestare all’interno delle nostre cellule.

Amminoacidi con R aromatici, non polari

• Fenilalanina = fenile.
• Tirosina = para-idrossibenzile.
• Triptofano = indolo.

Il triptofano viene messo in posizioni specifici, e ce ne sono pochi nelle proteine e conferiscono alla proteine delle caratteristiche particolari, quindi basta una mutazione per cambiare tutta la funzione delle proteine.

Hanno delle caratteristiche nel loro assorbimento delle radiazioni luminose.

Le proteine, in funzione dei residui aromatici che contengono, hanno delle caratteristiche spettroscopiche diverse. La misura dell’assorbimento della luce con uno spettrofotometro è utilizzata per identificare le proteine e per valutare la loro concentrazione in soluzione.

Spettrometro

Permette di studiare l’assorbimento delle radiazioni luminose generate da una lampadina.

In base ai residui aromatici permettono di monitorare le proteine.

Gli amminoacidi aromatici hanno degli spettri di assorbimento diversi.

Conoscendo la posizione dei triptofano si può calcolare il coefficiente di estensione molare.

Il massimo dell’assorbimento è nell’ultravioletto.

Ogni amminoacido presenta una sigla che può essere a tre lettere o a una lettera.

Mutazioni post-traduzionali e amminoacidi non proteici

Ci sono amminoacidi che subiscono delle mutazioni post-traduzionali che possono essere reversibili o irreversibili.

Ad esempio la prolina e lisina.

Avviene dopo che la proteina è stata sintetizzata.

Possono essere fosforilati e possono portare all’attivazione o l’inattivazione dell’enzima stesso.

Amminoacidi non proteici: essendo non proteici non entrano nella struttura della proteina ma sono degli intermedi metabolici.

Chiralità degli amminoacidi

Il carbonio in alfa, tranne per la glicina, è chirale (4 sost diversi).

Quindi esistono diversi isomeri degli amminoacidi, ha due enantiomeri, quindi hanno attività ottica perché ruotano il piano della luce polarizzata.

Gli amminoacidi possono esistere in due configurazioni diverse e per convenzione sono scritti attraverso forme geometriche in modo che la R e carbossile sono sotto al piano e il gruppo amminico e protone sono sopra la piano.

Gruppo amminico a sx = L.

Gruppo amminico a dx = D (nulla a che vedere con R e S).

Si possono usare anche le proiezioni di Fischer.

In natura, gli amminoacidi presenti nelle proteine sono L.

L’eccezione sono peptidi di alcuni batteri.

Diversi gradi di ionizzazione

Gli amminoacidi hanno un gruppo acido e basico.

Proprietà degli amminoacidi in soluzione.

In soluzione a pH neutro sono degli ioni bipolari ma con carica netta nulla.

Gli amminoacidi senza gruppi carichi sulla catena laterale, in soluzione a pH neutro sono in genere ioni dipolari (o zwitterioni). Un AA può quindi agire come acido (donatore di protone) e come base (accettore di protone).

Quindi, possono fungere, a seconda del pH, da acidi o basi.

Lo stato di ionizzazione di un amminoacido varia in funzione del pH.

Lo stato di ionizzazione di un amminoacido varia in funzione del pH.

A pH = 0 il gruppo amminico è completamente protonato.

Più si aumenta il pH e si ha una neutralità (forma zwitterionica).

A pH = 14 ci sarà la deprotonazione anche del gruppo amminico.

Quindi si possono studiare le curve di titolazione degli amminoacidi.

PI = punto isoelettrico cioè quando ha carica netta nulla ed è frutto dalla media dei due valori di pH.

Si ha un terzo equilibrio generato dal gruppo presente nella catena laterale.

Quindi si avrà 3 pKa.

Il PI è la media tra pK1 e pKr per il glutammato.

Invece la istidina si usa la pKa2 perché l’amminoacido ha carica netta zero tra pKa2 e pKar zero.

Devo vedere punto zero e trovare il punto mezzo. Cosa? AI N pI=(pK +pK)/2= 3.22 pI=(pK +pK)/2=7.591 R R 2.

Tabella riepilogativa.

Proteine

Come si formano?

Organizzazione degli amminoacidi per formare le proteine.

Le proteine si formano sul ribosoma attraverso la sintesi proteica.

La sintesi proteica è la condensazione di amminoacidi.

Condensazione = è una reazione che comporta la perdita di una molecola d’acqua, e questa molecola d’acqua la si può perdere andando a formare un legame peptidico (legame ammidico), attraverso un processo di disidratazione, perché il gruppo amminico e il gruppo carbossilico perdono una molecola d’acqua formando il legame peptidico.

Come si scrivono?

Convenzione = i polipeptidi (che nascono dalla condensazione di amminoacidi) sono scritti sempre lasciando come primo amminoacido con il gruppo ammino-terminale libero e poi l’ultimo amminoacido con il gruppo carbossi-terminale.

Questa convenzione si usa perché durante la sintesi proteica gli amminoacidi vengono aggiunti a partire dal residuo ammino-terminale IN/z/s.

Le unità amminoacidiche in un peptide sono chiamate residui = ogni residuo è un amminoacido che ha perso un protone dal suo gruppo amminico e un ossidrile dal suo gruppo carbossilico -H e OH-.

La spina dorsale del polipeptide è sempre seguita dall’ammino, poi C in alfa, poi C carbonilico e poi di nuovo ammino We.

Le R sporgono a destra dalla spina dorsale. Fine.

L'estremità ammino-terminale viene posta a sinistra e quella carbossilica a destra. La sequenza amminoacidica si legge da sinistra a destra, cominciando dall'estremità con il gruppo amminico libero.

Ci sono polipeptidi che anche se sono piccoli, sono fisiologicamente attivi e anche se sono a concentrazioni piccole.

Ad esempio ossitocina, bradichina, amanitina.

Aspartame = residuo di aspartato che legame un residuo di fenilalanina, la quale lega un gruppo un metile.

Quindi non serve che siano di grandi dimensioni per avere una attività fisiologica.

Il glutatione è un peptide che è formato da una molecola di glutammato, cisteina e glicina.

Avendo una molecola di cisteina, che contiene un SH libero, quindi può formare ponti disolfuro ed è un grado di fare da tampone redox, e quindi, ossidandosi, riesce a cedere due elettroni che possono essere utilizzati per contrastare i radicali dell’ossigeno.

È fatto solo da tre amminoacidi, e ha un legame peptidico anomalo perché fa il legame peptidico con la catena laterale.

Glucagone = ormone di natura peptidica.

Quando si parla di peptide e quando si parla di proteina?

Si inizia a parlare di proteina quando aumenta il numero di amminoacidi (ma non si ha una regola precisa).

Cosa distingue tra loro le proteine?

Caratteristiche chimico-fisiche delle proteine.

Le proteine hanno delle caratteristiche chimico-fisiche che le distingue, ad esempio:

• Peso molecolare = è definito a partire dal numero di amminoacidi. Mediamente il peso molecolare di un aminoacido è di 100 Dalton. Quindi una proteina che è costituita da 100 amminoacidi peserà 100.000 Da (perché 100x100).
• Punto isoelettrico PI = per l’amminoacido è il valore di pH in cui l’amminoacido ha una carica netta uguale a zero, e questa definizione vale anche per una proteina. Il PI della proteina è influenzato dalle cariche delle catene laterali, e bisogna anche considerare la posizione tridimensionale della catena laterale (quindi non solo dal tipo ma anche dalla porzione di queste R).

Il PI è caratteristico per ogni proteina e si è raffinato in base alla sua funzione biologica.

Esempio: gli istoni per potersi legare al DNA deve avere una carica positiva perché il DNA è carico negativamente, e perciò avrà un punto isoelettrico alto avendo tanti punti basici per potersi attaccare al DNA.

Bisogna tenere conto del pH della soluzione per capire la carica totale della proteina.

Emoglobina ha un PI a 7,1, quindi le sue funzioni cambiano in base al cambiamento del pH.

Queste caratteristiche chimico-fisiche come vengono sfruttate?

Sono utilizzate per l’analisi del materiale proteico.

Siero = componente liquida del sangue privata dei fattori di coagulazione (senza il fibrinogeno).

Plasma = invece il plasma contiene anche il fattori di coagulazione.

Elettroforesi del siero

È una tecnica con la quale si deposita sul supporto una miscela complessa composta da molecola cariche, e attraverso l’elettroforesi, le componenti proteiche si separano sul supporto in base alle loro caratteristiche chimico-fisiche (peso molecolare e PI).

Tipologie di grado di struttura delle proteine

La struttura delle proteine https://app.jove.com/it/embed/player?id=10678&t=1&s=1&fpv=1.

Ci sono vari livelli di complessità della struttura delle proteine: primaria, secondaria, terziaria, quaternaria.

• Primaria = è la sequenza amminoacidica.
• Secondaria = è la sequenza amminoacidica che si riorganizza nello spazio per generare degli elementi di struttura secondaria: alfa elica e foglietto beta.
• Terziaria = si riorganizzano la struttura secondaria e conferisce alla proteina la sua funzionalità.
• Quaternaria = alcune proteine che sono costituite da più di una catena polipeptidica presentano la struttura quaternaria.

Struttura primaria

Rappresenta la sequenza amminoacidica in cui gli amminoacidi sono legati tra loro da legami covalenti che possono essere i legami peptidici o i legami disolfuro.

Tutte le proteine esistenti derivano dalla combinazione dei 20 amminoacidi naturali.

La sequenza amminoacidica è il punto di congiunzione tra il messaggio presente sul DNA e la struttura tridimensionale di una proteina che è correlata alla funzione biologica.

La sequenza amminoacidica è unica per ogni tipo di proteina, infatti ogni molecola di una determinata proteina presenta la stessa sequenza amminoacidica.

Se si fa una variazione alla sequenza amminoacidica succede una mutazione che può comportare l’insorgenza di una proteina patologica.

Ad esempio: anemia falciforme = la catena B della emoglobina ha una mutazione in porzione 6 (glutammato sostituito con una valina), e questo comporta che la proteina non ha più le stesse caratteristiche della proteina originale.

Ci sono classi di proteine che hanno una struttura primaria molto simile ma hanno delle differenze nelle funzioni biologiche.

Quindi se si altera la struttura primaria di una proteina, si altera anche la sua funzione, perché è stata empiricamente riconosciuta questa relazione tra la sequenza amminoacidica e la funzione di una proteina.

Esempio: vasopressina e ossitocina = sono due ormoni che hanno una sequenza molto simile perché differiscono per uno/due amminoacidi, ma hanno due funzioni molto diverse se pur avendo una sequenza amminoacidica molto simile.

Evoluzione

L’evoluzione di un organismo è legata all’insorgenza di mutazioni spontanee che avvengono a livello dei geni.

Le differenze nella struttura primaria sono la “memoria” dei cambiamenti avvenuti a livello genetico nel corso dell’evoluzione.

Le specie che presentano una notevole affinità, avranno anche delle strutture primarie delle proteine comuni molto simili tra loro.

Esempio: citocromo-C = a livello primordiale c’era solo una sequenza del citocromo-C, e poi alcune mutazioni hanno portato al regno dei funghi e quindi si potrà creare degli alberi genealogici.

Come può avvenire?

Duplicazione genetica.

Avviene nei processi di replicazione come mitosi e meiosi.

Una proteina può essere duplicata e quindi si ha due copie dello stesso gene per la stessa proteina. Ma questo gene può mutare e quindi si creano delle proteine che hanno delle sequenze simili e quindi avranno anche una funzione analoga.

Queste sequenze sono partite da un progenitore comune.

Ad esempio globine = proteine che andranno a formare la mioglobina (proteina monomerica che lega l’ossigeno) e l’emoglobina (ce ne sono vari tipi: adulte che lega ossigeno e non fa da deposito ma da trasporto).

Quindi prima esisteva una globina primordiale che poi tramite le duplicazioni ha dato origine a varie globuline.

Ad esempio si può vedere diversi allineamenti di sequenza tra i tipo di globuline e nei riguardi si trovano le porzioni di sequenza e gli amminoacidi che vengono mantenuti invariati (però non si ha molta similitudine).

Però ci sono delle posizioni che non possono variare, ad esempio l’istidina si trovano sempre nelle stesse posizioni.

Quindi, si può capire, le istidine sono molto importanti per legare l’ossigeno.

Caratteristiche del legame peptidico della struttura primaria

Ha un legame peptidico che si forma durante la condensazione di due amminoacidi.

Può presentare delle strutture di risonanza, perché il carbonile ha una parziale carica negativa a livello dell’ossigeno e c’è l’azoto che cede il suo doppietto e quindi ha una carica parzialmente positiva.

Queste risonanze conferiscono una maggiore stabilità e la presenza di un dipolo elettrico.

Il legame peptidico ha un parziale carattere di doppio legame (come lo si può vedere dalle strutture di risonanza) A1,32.

Infatti la lunghezza del legame è una lunghezza intermedia tra un legame singolo e doppio.

E poi rende il legame complanare e quindi non c’è libera rotazione attorno al legame peptidico, e quindi i 6 atomi implicati nel legame peptidico giacciono sullo stesso piano.

Quindi ci sono legami mobili = C in alfa e legami fissi CN C.

Quindi ci sono piani rigidi che si alternano con dei legami mobili che sono i legami tra il C in alfa e l’azoto, e il C in alfa e il C del carbonile.

Come per gli alcheni, il peptide è quello più stabile in configurazione trans perché c’è meno ingombro sterico.

Oltre il 99% dei legami peptidici nelle proteine hanno configurazione trans.

L’1% è dato dal legame peptidico che è coinvolta la prolina: eccezione.

Perché il C in delta dell’anello pirrolidinico che fa un ingombro sterico con la catena laterale.

Infatti c’è un 6% di configurazione cis in cui si trova la prolina.

Tra il gruppo amminico e il C in alfa, e il gruppo carbonilico e il C in alfa ci sono due legami mobili quindi possono avere degli angoli di torsione.

L’angolo di torsione tra N e il C in alfa è chiamato angolo xi I.

L’angolo di