Biochimica applicata medica e biochimica clinica

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BIOCHIMICA CLINICA

Esame orale su argomen� trata� a lezione

PROGRAMMA

Organizzazione di un Laboratorio Biochimico Clinico e il Processo Diagnos�co

• Definizione di un Biomarcatore Clinico ed Enzimi di Significato Clinico

• Test di valutazione della Funzione Epa�ca

• Test di valutazione della Funzione Renale

• Biomarcatori dello Stato Nutrizionale e Dislipidemie

• Biomarcatori di Danno Cardiovascolare

• Coagulazione ed Emostasi

• Sistema Endocrino: Ipofisi, Tiroide e Surreni

• Diabete Mellito

• MEDICINA DI LABORATORIO

CENNI INTRODUTTIVI SULLA MEDICINA DI LABORATORIO E PERCORSO DIAGNOSTICO

La medicina di laboratorio è una scienza quan�ta�va che si occupa della misurazione delle quan�tà

(concentrazioni) biologicamente rilevan� (anali�) presen� nei fluidi corporei. allo scopo di fornire

I metodi per la misurazione di queste sostanze sono progeta� in modo rigoroso

valutazioni accurate della loro concentrazione.

refer�,

I risulta� delle analisi, i vengono u�lizza� per scopi diagnos�ci, nella prevenzione o nella l’efficacia

della terapia farmacologica.

Si divide in 4 fasi:

DIAGNOSI

 Confermare o escludere un sospeto diagnos�co di patologia.

SCREENING

 Indagini che vengono chieste in assenza di un segno o sospeto clinico dalla Medicina Preven�va

PROGNOSI

 Un singolo test, o gruppi di test, possono essere u�lizza� per fornire informazioni nel predire lo

sviluppo di una patologia.

FOLLOW UP MONITORAGGIO TERAPEUTICO

e

 Un test può essere usato per monitorare il decorso di una mala�a

Esempio di referto:

Il numero in grasseto è quello misurato, che

viene dato dal laboratorio (ex. leucoci� 7.38), si

ha l’unità di misura (ex. *10^9/L) e un intervallo

di riferimento che è fondamentale e viene

fornito dal laboratorio (ex. 4,40-15). Le ul�me

due colonne rappresentano risulta� preceden�,

u�li per effetuare un confronto. 2

Nella medicina di laboratorio è possibile individuare alcune soto categorie:

Chimica clinica:

- potassio, calcio, cloro, elemen� misura� in questo campo

Ematologia:

- conta dei globuli rossi, globuli bianchi, conta eritrocitaria.

Emostasi e coagulazione:

- tempo di protrombina,

Immunologia:

- presenza di determinate popolazioni eritrocitarie coinvolte in determinate patologie

farmacologia:

- azione di farmaci su determina� ormoni

biologia molecolare:

- analisi geniche

microbiologia:

- analisi di laboratorio

IL PERCORSO DIAGNOSTICO

problema

1. il paziente avverte un di salute

informazioni

2. raccolta delle tramite esame obie�vo e test diagnos�co appropriato

3. diagnosi dal clinico

tratamento

4. terapeu�co/ farmacologico che si basa su:

- Rapporto di Collaborazione Paziente Medico

- Appropriatezza della richiesta del test di laboratorio

- Modalità di raccolta, trasporto e conservazione del campione biologico

- Tempo di atesa di risposta al risultato del test

- Accuratezza dell’interpretazione e u�lizzazione dei risulta�

APPROPRIATEZZA IN MEDICINA DI LABORATORIO beneficio al

Definizione: Appropriatezza è una procedura (diagnos�ca e/o terapeu�ca) che produce un

paziente. le migliori terapie di cura,

Una diagnosi accurata e tempes�va non solo assicura al paziente ma impata

processi di programmazione sanitaria cos�

anche posi�vamente sui e sui del sistema sanitario e del

paziente.

FASI DEL PROCESSO ANALITICO

PREANALITICA: Prelievo, Trasporto e Conservazione e Ges�one del Campione con più errori

 fase

ANALITICA: Metodo di Analisi

 POSTANALITICA: Risulta�/Referto



LA FASE PREANALITICA

fase preanali�ca

La comprende diversi passaggi procedurali dove l’incidenza di diverse variabili possono

qualità del campione, risulta� u�lizzo

influire sulla sui di laboratorio e sul loro clinico.

non controllo di qualità interno esterno fatori di variabilità

La fase preanali�ca è sotoposta al o e i di

questa fase sono difficilmente controllabili e possono causare errori (bias) sul risultato finale/referto.

- La precisa iden�ficazione e rintracciabilità del campione (uso del codice a barre dei campioni)

- La correta modalità di prelievo (ambiente, impiego materiali e disposi�vi idonei, evitare stasi e

an�coagulan�)

- La correta modalità di trasporto e separazione siero e plasma

- La correta modalità di conservazione dei campioni (effe� da temperatura, fotosensibilità,

liofilizzazione, pH e conservan�)

A. IDENTIFICAZIONE

- Da� personali del paziente e rela�vi al prelievo

B. MOTIVAZIONE DELLA RICHIESTA 3

C. CONDIZIONI PARTICOLARI DEL PAZIENTE

D. NOME DELL’ANALISI INEQUIVOCABILE

La matrice biologica

Prelievo di sangue: Venoso, capillare o arterioso

Raccolta delle urine estemporanea o delle 24 ore

Raccolta della saliva (Biologia Molecolare, ormoni, analisi di

droghe)

Raccolta delle feci (sangue occulto, protozoi patogeni,

platelmin�)

Prelievo del Liquor cefalorachidiano (meningite, sclerosi mul�pla)

Variabilità preanali�ca: il prelievo del sangue

Plasma: si centrifuga un campione di sangue in presenza di an�coagulante

Siero: si fa coagulare il sangue prelevato (30 minu� di media). Poi si centrifuga e si separa la parte liquida

soprastante dalla parte corpuscolata sotostante (che include il coagulo)

La raccolta del campione ma�no digiuno

Il prelievo venoso deve essere eseguito al (tra 8-10 h), a da almeno 8 ore.

Fatori cri�ci che influenzano gli esami:

Dieta Ipercalorica o iperproteica o assunzione di alcool

• Esercizio fisico

• Postura

• Tratamento Farmacologico

•

Variabilità preanali�ca: raccolta del campione

Errori nella preparazione del paziente:

glicemia non digiuno.

1. Misura della in condizioni di

anali� farmaci interferiscono

2. Misura di (aldosterone, renina) in presenza di an�ipertensivi che con

il risultato finale.

ormoni sensibili circadiano.

3. Misura di al ritmo

Ad esempio: la postura è un fatore importante perché in posizione ortosta�ca il volume plasma�co

diminuisce di circa il 10% ed aumenta quello del liquido inters�ziale

Variabilità preanali�ca: ritmi cronobiologici

Sono note le variazioni ritmiche nel tempo di alcuni cos�tuen� biochimici. I ritmi più diffusi sono quelli

circadiani (sonno-veglia, temperatura corporea)

Sangue: ACTH, cor�solo, VES, gonadotropine, sideremia, calcemia, serotonina.

• Urine: varia l’escrezione urinaria di catecolamine, Na, K

• 4

Variazione giornaliera del cor�solo Alcuni ormoni dipendono dal ritmo sonno veglia. Il

cor�solo ha un picco tra le 7 e le 9 del ma�no e poi si

riduce, se bisogna richiedere la valutazione di questo

ormone, il prelievo deve avvenire in questo periodo di

tempo, ad esempio nel caso si pensi si abbia una

alterazione del rilascio di cor�solo da parte del surrene.

Effeto dei farmaci

Assunzione dei farmaci può provocare problemi nell’interpretazione sopratuto quando non si può

interrompere la somministrazione.

Tipi di interferenza:

- Farmacologica in vivo



Può essere dovuta all’azione farmacologica stessa del farmaco o ad una azione immunologica o

tossicologica

DIURETICI, ALCUNI STEROIDI: alterano la concentrazione degli eletroli�

• CONTRACETTIVI ORALI: aumento della concentrazione di glucosio, insulina, ormone della crescita,

• cor�solo, �roxina, fatori della coagulazione, colesterolo e diminuzione dell’an�trombina III

MORFINA E METILDOPA: aumentano il tasso di catecolamine nel sangue

• VITAMINA K: aumenta la sintesi epa�ca di protrombina

• VITAMINA D: modifica la calcemia

•

- Anali�ca in vitro



È una interferenza con il metodo anali�co. È la più diffusa e può dare risulta� falsamente posi�vi o

nega�vi.

Di �po fisico – fotometrica (assorbimento, fluorescenza, torbidità)

• Di �po chimico - alterazioni nella reazione chimica

•

La raccolta del campione

Si s�ma che quasi il 70% degli errori nel processo diagnos�co siano atribuibili alla fase preanali�ca

(campionamento, trasporto e conservazione dei campioni).

Principali cause di errore:

Campione emolizzato (55%)

• Campione insufficiente (25%)

• Campione coagulato (20%)

•

Errori nella modalità del prelievo: emolisi, scelta del coagulante non

idoneo.

Campione latescente con elevato valore di trigliceridi.

L’emolisi è causa di errore per il passaggio di emoglobina e di altre sostanze dagli eritroci� al siero (o

plasma).

L’emoglobina può interferire con metodi di dosaggio colorimetrici (assorbimento a diverse

• lunghezze d’onda) e inibire alcune reazioni chimiche 5

Le sostanze la cui concentrazione eritrocitaria è maggiore di quella del plasma, misurate nel siero/

• plasma, risultano sopravvalutate.

Variabilità preanali�ca: an�coagulan�

Addi�vi che inibiscono la coagulazione del sangue senza interferire sulla misura degli anali�.

Eparina: Viene u�lizzato sopratuto in chimica clinica (dosaggio degli ioni plasma�ci)

• EDTA (acido e�lendiamminotetrace�co sale bi-tripotassico o bisodico):

• Chelante del calcio e viene u�lizzato per esami ematologici

Citrato di Na: Viene u�lizzato per i test di coagulazione (PT, PTT)

•

Variabilità preanali�ca: i glicosta�ci

Il Glucosio è metabolizzato dagli eritroci�, e quindi la sua concentrazione si riduce nel tempo a contato con

i globuli rossi. glucosio 5%

La concentrazione del in un prelievo di sangue varia del circa per ora a temperatura ambiente.

citrato fluoruro di sodio

Le provete per la glicemia contengono e che inibiscono la glicolisi anaerobica

(glicosta�ci)

Le procedure di conservazione migliori per il glucosio consistono nella immediata centrifugazione.

Dopo la centrifugazione, il glucosio è stabile per 8h a 24 gradi e 72h a 4 gradi.

Altre fon� di variabilità pre anali�ca

Un’altra fonte di variabilità preanali�ca, che interferisce sensibilmente sulla qualità del risultato, è

riempimento non o�male della proveta.

rappresentata dal

insufficien� per quan�tà

Campioni sono, infa�, ritenu� non idonei ad essere processa�.

il rapporto sangue-an�coagulante raccomandato per un correto riempimento della proveta per gli esami

9 par� di sangue e 1 parte di an�coagulante

della coagulazione è (9:1).

Trasporto e conservazione del campione

Il correto trasporto e conservazione del campione biologici rappresenta un prerequisito essenziale per

qualità

assicurare la della misura anali�ca.

Nel trasporto del campione evitare:

Esposizione a vibrazioni o scuo�men� del campione

• Esposizione alla luce

• Esposizione al calore

• Contaminazioni chimiche e microbiche

• Tempi rapidi di consegna in laboratorio in ada� contenitori

•

Accetazione dei materiali e verifica di idoneità

Verifica dell’adozione di tute le misure previste nella fase preanali�ca

criteri di non accetabilità:

Iden�ficazione assente o incompleta

• Mancanza di informazioni necessarie per eseguire il test

• Contenitore inidoneo o non integro

• Prelievo non correto

• Quan�tà non sufficiente

• 6

Rapporto sangue/an�coagulante scorreto

• Mancata aggiunta del conservante

• Presenza di coaguli, emolisi

• Conservazione a temperatura non correta

• Esposizione alla luce solare direta

• Congelamen� / scongelamen� ripetu�

•

VARIABILITA’ ANALITICA

Rappresenta la variabilità quan�ta�va del test di laboratorio

Fase Anali�ca consente di otenere una misura o valore quan�ta�vo di un analita che rappresen� una s�ma

il più possibile fedele al valore vero.

I risulta� quan�ta�vi forni� dalle misure anali�che del laboratorio sono influenza� da due �pi di variabilità:

Anali�ca

Variabilità

• Biologica

Variabilità

•

Le fon� di variabilità anali�ca dipendono da:

Reagen�:

- modalità di preparazione, conservazione e scadenza.

Calibratori:

- variabilità tra lo�, modalità di conservazione e preparazione

Strumen�

- u�lizza� per le misure

Operatori:

- mancata formazione tecnica o inadeguata preparazione

L’errore della fase anali�ca è molto basso rispeto a quello della fase preanali�ca.

Controlli di qualità delle performance delle strumentazioni

Controlli di qualità delle performance dei rea�vi

Processi di automa�zzazione dell’analisi (errori dell’operatore quasi trascurabili)

Fase anali�ca

U�lizzo di test idonei, economici, rapidi automa�zza� e informa�zza� che forniscono una misura (ad es.

concentrazione, a�vità) di uno specifico analita più vicino possibile alla misura reale

Metodi anali�ci

Eletroforesi delle proteine: caraterizza la presenza di una proteina monoclonale nel sangue, nell’urina o

nel liquor, separandola dalle proteine normali mediante eletroforesi.

Citometria a flusso: iden�fica il �po di cellule linfocitarie (linfoci� B, linfoci� T, macrofagi...) mediante

l’u�lizzo di an�corpi fluorescen� specifici per l’an�gene cellulare.

Emocromo: conta e il dimensionamento dei globuli rossi e delle piastrine, la concentrazione di emoglobina

e la conta differenziale dei leucoci�.

Misura degli eletroli� Na, K, Ca, Mg mediante eletrodi iono-sele�vi.

Metodi Immunochimici o Immunoenzima�ci (ELISA): rileva an�corpi specifici nel plasma del paziente

legando a uno specifico an�gene.

PCR: reazione a catena della polimerasi 7

VARIABILITA’ BIOLOGICA

- variabilità intra-individuale

- variabilità inter-individuale

VARIABILITA’ ANALITICA

principali fon� della variabilità’ intra-individuale

Ritmi circadiani

• Dieta

• Periodo mestruale

• Gravidanza

•

principali fon� della variabilita’ inter-individuale

Sesso

• Età

• Razza

• massa corporea

• fumo

• Alcool

•

FASE POST ANALITICA

il referto

Il laboratorio clinico fornisce informazioni u�li per la diagnosi, la terapia, il monitoraggio della terapia.

Il referto deve descrivere corretamente gli anali� misura� e risponde compiutamente alla richiesta del

clinico ed alle atese del Paziente.

Il Referto deve essere tempes�vo, cioè dato in tempi u�li alla ges�one appropriata del paziente e u�lizzato

nel processo diagnos�co-terapeu�co.

Carateris�che:

- Iden�ficazione del Campione

- Data dell’Esame Risultato

- Risultato e il range di Riferimento

- Metodo U�lizzato

Medicina di laboratorio

I risulta� delle analisi vengono espressi come numeri e indica� con una unità di misura (ad es. Na+ 137

mmol/L).

I risulta� delle analisi vengono messi a confronto con un intervallo di riferimento, basato sui valori

documenta� di una popolazione di riferimento.

GLI INTERVALLI DI RIFERIMENTO

intervalli di riferimento

Gli non sono dei numeri assolu� che valgono per tu�, ogni laboratorio può usare

dei kit diversi e e ci possono essere delle piccole variazioni nell’intervallo di riferimento che può avere un

valore minimo e uno massimo. variabilità biologica analita

Intervalli di riferimento (IR) misurano la di un in presenza e in assenza di

mala�a. 8

Gli intervalli di riferimento di un analita vengono determina� dalle misure che si otengono da un gruppo di

campione di riferimento che presenta carateris�che antropometriche il più possibile omogenee (sesso, età,

etnia, fumo…). popolazione di riferimento,

Dobbiamo prendere una al suo

campione

interno dobbiamo prendere un (almeno 500

sogge�) il più possibile omogeneo che abbia le stesse

carateris�che antropometriche, poi si misura in maniera

standardizzata con strumentazioni un analita, si otengono

numeri elabora�

dei che verranno dal punto di vista

sta�s�co ricavo una curva gaussiana in modo da determinare

un limite inferiore ed uno superiore.

Linee guida raccomandano di considerare un intervallo di

riferimento all’interno del 95 percen�le.

La distribuzione normale o gaussiana

consente di determinare i livelli di

riferimento di un gruppo campione.

valore medio

Il si trova esatamente

centro della distribuzione,

al e la

simmetrica

curva è rispeto ad essa.

La maggior parte delle osservazioni si

concentrano intorno al valore medio

e , allontanandosi dal valore medio, si

hanno osservazioni che risultano

molto distan� dalla media. Nel caso

sia selezionato un altro gruppo di

sogge� dalla stessa popolazione di riferimento, non si oterranno esatamente gli stessi limi� di

riferimento. 95%

Per una �pica distribuzione a campana (gaussiana) circa il di tu� i valori sono inclusi entro due

deviazioni standard della media e circa il 99% di tu� i valori sono compresi entro tre deviazioni standard

della media.

N.B. Alcuni test presentano una sensibilità superiore al 95%, come nel caso del troponide.

non corrispondono ai livelli decisionali del clinico,

Gli intervalli di riferimento ci possono essere livelli

dentro l’intervallo ma possono essere comunque considera� patologici → quindi è il clinico che comunque

decide se il soggeto è malato o meno.

Esempi di intervalli di riferimento:

Glicemia: va misurata a digiuno, un soggeto normoglicemico ha valori minori di 100 mg/dL; i clinici

• due intervalli decisionali<