Biochimica

Amminoacidi e proteine

Gli amminoacidi sono acidi carbossilici che presentano anche un gruppo amminico, essi sono tutti α-amminoacidi (ovvero il gruppo amminico è in alfa al gruppo carbossilico) e tutti a configurazione L, dovuta alla presenza di un centro stereogenico in alfa. Gli amminoacidi codificati nel genoma umano sono 20 e vengono raggruppati sulla base delle proprietà della catena laterale (variabile):

• Alifatica non polare: Glicina, Alanina, Prolina, Valina, Leucina, Isoleucina, Metionina;
• Polare non carica: Serina, Treonina, Cisteina, Asparagina, Glutammina;
• Aromatica: Fenilalanina, Tirosina, Triptofano;
• Caricati positivamente (basici): Lisina, Arginina, Istidina;
• Caricati negativamente (acidi): Aspartato (A. Aspartico), Glutammato (A. Glutammico).

Oltre ai 20 amminoacidi codificati, nel nostro organismo sono stati trovati anche amminoacidi non standard, ottenuti tramite modifiche post-traduzionali di quelli esistenti:

• 4-Idrossiprolina: La mancata idrossilazione della prolina è stata riscontrata in individui affetti da scorbuto;
• γ-Carboglutammato: È presente nella protrombina. La mancata carbossilazione causa emorragie incontrollate;
• Desmosina: Costituita da 4 residui di Lisina legati ad un anello aromatico. È stata trovata nell’elastina;
• Ornitina e Citrullina: Sono intermedi del ciclo dell’urea;
• β-Alanina: È una componente dell’acido pantotenico (vitamina B5).

Gli amminoacidi, possedendo due gruppi funzionali polari, possono esistere in due forme: una non ionica e una zwitterionica, in cui entrambi i gruppi sono ionizzati. Se prendiamo la glicina, ad esempio, il pH a cui è presente in forma zwitterionica è 5,97 (punto isoelettrico). Ogni amminoacido possiede un proprio punto isoelettrico diverso dagli altri, il che consente di effettuare una separazione selettiva di miscele di amminoacidi.

Tutti quegli amminoacidi non prodotti dal nostro organismo devono essere introdotti con l’alimentazione: stiamo parlando degli amminoacidi essenziali. Sono molto importanti, in quanto qualora fossero assenti, l’intera sintesi proteica sarebbe interrotta (anche se gli altri amminoacidi sono presenti); si può dire che gli amminoacidi essenziali costituiscano una sorta di reagente limitante. Questi amminoacidi possono essere introdotti mediante carne, pesce, uova, latte e formaggio, quindi proteine animali, in minor quantità mediante proteine vegetali.

Legame peptidico

Il legame che si forma fra gli amminoacidi coinvolge il gruppo carbossilico del primo amminoacido e il gruppo amminico dell’amminoacido seguente: si instaura il cosiddetto legame peptidico (o carboammidico) con perdita di una molecola d’acqua (condensazione):

Si definiscono peptidi quei polimeri con più di 50 amminoacidi, con peso molecolare non superiore a 5000 e con peso molecolare medio non superiore a 110. Sono presenti nelle cellule in quanto possono essere prodotti di degradazione parziale delle proteine o perché possono svolgere funzioni specifiche:

• Bradichinina: Ormone antinfiammatorio;
• Ossitocina: Causa la contrazione della muscolatura uterina e la produzione di latte;
• Encefaline: Piccoli peptidi con attività oppiacea (il latte materno ne è ricco).

Classificazione delle proteine

Le proteine possono essere classificate in base a diversi criteri: in base alla struttura (semplici o complesse), in base alla forma (fibrose o globulari). A volte, classificarle in base alla loro funzione può essere più esplicativo riguardo al ruolo che quella proteina ha. Possono avere funzioni di trasporto, per esempio di O₂ e CO₂ grazie all’emoglobina, oppure di riserva o protezione, controllo tampone del pH o accettori/trasportatori/conduttori di energia.

Struttura delle proteine

• Struttura primaria: Consiste nella sequenza di amminoacidi che sono codificati dai geni. È la più diretta informazione della sequenza genica e anche quella che definisce l’attività biologica; è importante per ricreare in laboratorio determinate proteine e per studiare eventuali mutazioni o anomalie a carico della sequenza, che siano fisiologiche (es. vasopressina e ossitocina, molto simili) o patologiche. È importante anche dal punto di vista evolutivo, perché proteine come il citocromo C evidenziano cambiamenti nella sequenza genica dai primordi fino ad oggi.
• Struttura secondaria: Riguarda la disposizione della catena nello spazio in base all’interazione con proteine vicine. Queste interazioni riguardano perlopiù legami a idrogeno a livello di Ossigeno o Azoto del legame peptidico. Il legame peptidico è un legame polare, planare e stabilizzato per risonanza: il parziale carattere di doppio legame impedisce la rotazione attorno al legame CO-N, costringendo la molecola ad un’isomeria trans che peraltro è la più favorita dal punto di vista termodinamico (minima repulsione sterica tra i gruppi laterali e massimo numero di legami a idrogeno). Ciò porta la proteina ad assumere una struttura elicoidale chiamata α-elica.
• Struttura terziaria: Riguarda la disposizione tridimensionale della catena polipeptidica, ovvero come la struttura si ripiega nello spazio. Si può intuire che questa struttura riguarda tutte quelle zone non impegnate nella struttura secondaria e, in virtù del ripiegamento, molti residui fino ad allora lontani si trovano vicini. Si tratta di un tipo di struttura dinamica, che cambia a seconda dell’attivazione della proteina e stabilizzata da legami principalmente di quattro tipi:

• Ionico: Gruppi a carica netta positiva (es. lisina e arginina) o negativa (glutammico, aspartico, COOH terminali…);
• A idrogeno: Dovuti alla presenza di acqua o alla presenza di gruppi accettori di idrogeno;
• Idrofobico: In tal caso, le catene apolari si dispongono in modo da essere esposte il meno possibile al solvente se è polare;
• Ponte disolfuro: Si crea quando dei gruppi SH si trovano spazialmente vicini, appartenenti per esempio a residui di cisteina. Sono tipici perlopiù degli ambienti più soggetti ad insulti esterni, che siano chimici o meccanici;
• Con ioni metallici: Come Zinco, Ferro (contenuto nell’emoglobina).

La struttura riveste un ruolo fondamentale, in quanto la perdita di essa influisce anche sulla sua funzione, determinando la cosiddetta denaturazione. Questa può essere operata mediante somministrazione di calore (in un determinato intervallo di temperatura) o di energia elettrica (elettroforesi). Altri agenti denaturanti possono essere pH estremi, solventi organici, guanidina cloridrato o detergenti, e ognuno causa uno specifico grado di denaturazione. Quel che è importante ricordare è che la denaturazione è un processo il più delle volte reversibile, quindi può essere operata una rinaturazione, e questo avviene proprio grazie alla struttura primaria che è in grado di determinare quella terziaria.

Proteine fibrose

Un esempio di struttura terziaria è quella delle proteine fibrose: in queste è prevalente la struttura secondaria, che assume organizzazione superiore. Non a caso, queste proteine offrono sostegno, resistenza e protezione al tessuto connettivo (si pensi a squame, unghie…):

• Cheratina: Per l’appunto le unghie sono costituite da polimeri di cheratina disposti a α-elica; questi polimeri si associano formando doppi filamenti, che si organizzano fino a formare strutture molto compatte, che costituiscono anche i capelli.
• Collagene: È il componente principale del tessuto connettivo, costituito da 3 α-eliche sinistrorse legate fra loro saldamente, che lo rendono una proteina notevolmente resistente alla rottura, ma molto rigida.
• Elastina: È una proteina dalle notevoli proprietà elastiche. Strutturalmente è simile al collagene, ma presenta residui di desmosina, che provoca un arrangiamento elicoidale poco compatto.
• Fibroina: È il costituente principale della seta e delle ragnatele, costituita da strutture β-sheet disposte in modo da alternare alanine e glicine. Possiede una notevole flessibilità e resistenza grazie ai legami a idrogeno che riesce a formare e alle forze di Van der Waals globali.

Proteine globulari

Sono strutture compatte ma meno ordinate di quelle fibrose. Hanno spesso funzione di trasporto, catalisi o regolazione (si pensi a enzimi, ormoni peptidici, recettori o anticorpi) e possono essere liposolubili o idrosolubili. La struttura classica presenta brevi tratti di α-elica o β-sheet collegati fra loro da tratti non a struttura secondaria.

La particolarità delle proteine globulari è che possono assumere struttura terziaria e anche quaternaria. Quest’ultima determina come delle catene polipeptidiche si associano fra loro tramite interazioni non covalenti, chiamate protomeri, che definiscono la geometria della molecola e che consente ad essa di avere le proprietà che i monomeri non hanno. Un esempio di proteina globulare è per l’appunto l’emoglobina.

Emoglobina e mioglobina

Sono state le prime proteine delle quali è stata determinata la struttura tridimensionale. L’emoglobina ha il compito di trasportare l’ossigeno a tutti i tessuti, anche periferici, mentre la mioglobina lega e immagazzina l’ossigeno di riserva del muscolo.

• Mioglobina: Ha PM=16700, è molto compatta e il 78% della struttura è disposta a α-elica. Il gruppo eme è localizzato in una fenditura all’interno, mentre la superficie espone verso l’esterno dei residui di propionato.
• Emoglobina: Ha PM=68000 ed è costituita da 4 catene uguali legate covalentemente a due a due fra loro, subunità α e β, in contatto fra loro grazie alla forma quasi sferica che assume il tetramero. Tale forma è dovuta alla presenza di residui CD1 (Phe) e F4 (Leu), che ostruiscono la tasca idrofobica e creano un ambiente idrofobico per il gruppo eme, e del residuo C2 (Pro) che crea un “gomito” e fa cambiare direzione al filamento.

Qui è rappresentata la molecola dell’emoglobina e a destra il gruppo eme. Questo è composto da un anello porfirinico e da uno ione Ferroso, perciò è definibile una ferro-protoporfirina IX. Come si può vedere, i gruppi idrofilici sono entrambi dallo stesso lato e il Ferro (II) assume una posizione centrale: forma 4 legami di coordinazione con gli azoti porfirinici e 2 perpendicolari al piano della porfirina, ovvero il 5^o legame è con un residuo di Istidina (F8) e il 6^o è con l’Ossigeno (che instaura un legame a idrogeno con una Istidina distale E7 o His⁶⁴). Il Ferro resta allo stato di ossidazione +2 grazie agli azoti elettrondonatori che gli impediscono di ossidarsi.

Ciò che rende l’emoglobina così interessante è la reversibilità di legame che offre il gruppo eme: l’affinità per l’Ossigeno è alta a livello degli alveoli polmonari e bassa a livello dei tessuti periferici. Come sappiamo, non solo l’Ossigeno si lega all’emoglobina: un’altra molecola che può legarsi al Ferro al posto dell’Ossigeno è il Monossido di Carbonio (CO) con due diverse geometrie, angolare o lineare: Quando il gruppo eme dell’emoglobina è isolato (ovvero quando non ci sono altri gruppi eme nelle vicinanze), l’affinità del monossido di carbonio per il Ferro è 25000 volte maggiore di quella del Ferro per l’Ossigeno. Se si tratta di mioglobina, l’affinità scende a 250 volte.

Tuttavia, il CO è anche un prodotto di scarto del nostro organismo, per questo abbiamo imparato a mitigarne gli effetti: l’Istidina E7 costringe il monossido di carbonio a legarsi al ferro con una geometria angolare, che rende il legame più debole. Se però la concentrazione nell’aria respirata aumenta, la sopravvivenza non è garantita e si rischia la morte per intossicazione.

Saturazione frazionale

È la frazione dei possibili siti di legame a cui è effettivamente legato l’Ossigeno, tenendo conto che la concentrazione di O₂ è riportata sottoforma di pressione parziale (pO₂) ed è espressa in Torr. Il valore di pO₂ a cui tutti i siti sono occupati dall’Ossigeno è di 2 Torr, e viene indicato con P₅₀ (50% della saturazione). Questo parametro ci consente di valutare in altri termini l’affinità per l’Ossigeno di mioglobina ed emoglobina: infatti, mentre per la mioglobina P₅₀ è a 2 Torr, per l’emoglobina P₅₀ è a 26 Torr.

Struttura e funzionamento

Il funzionamento dell’emoglobina è particolarmente complesso, in quanto l’interazione con un ligando modifica le proprietà su un altro sito sulla stessa molecola mediante una modificazione conformazionale: questo definisce una proteina allosterica e un’interazione/regolazione che porta lo stesso nome. Le conformazioni possibili derivanti da questa interazione sono state analizzate con tecniche a raggi X e sono essenzialmente due: una tense che possiede una bassa affinità per O₂, e una relaxed che possiede alta affinità per O₂; in altre parole, il legame con l’Ossigeno stabilizza R, mentre se l’Ossigeno manca, T è la conformazione più stabile.

N.B.: Nei soggetti affetti da anemia falciforme, come sappiamo, c’è la sostituzione di Acido Glutammico con la valina. Ciò porta ad avere zone idrofobiche che si organizzano in fibre molto lunghe e compatte (che causano la forma a falce) per far sì che le zone idrofobiche siano “nascoste” all’ambiente acquoso.

Trasporto dei gas

Oltre a trasportare Ossigeno, l’emoglobina è in grado di trasportare anche anidride carbonica; infatti, a livello periferico è favorito il rilascio di O₂ e il legame con CO₂, mentre a livello polmonare è favorito il rilascio di CO₂ e il legame con O₂. L’efficienza di questo meccanismo è da attribuire al pH, ovvero in periferia il pH è minore di 7,4 per l’alta concentrazione di CO₂ disciolta nel sangue (che lo rende acido), invece a livello polmonare il pH è maggiore di 7,4 per la bassa concentrazione di CO₂. Questo effetto del pH sullo scambio O₂/CO₂ è chiamato effetto Bohr, e si basa sul legame a idrogeno e sul ponte salino che si forma fra His¹⁴⁶ e Asp⁹⁴ (sia il legame a idrogeno, sia la formazione del ponte salino, sono fattori influenzati dalla protonazione di His).

Regolazione allosterica e affinità generale

Gli studi hanno dimostrato che l’affinità dell’emoglobina per l’Ossigeno nei globuli rossi è più bassa di quella libera in soluzione, e ciò è dovuto alla presenza nei globuli rossi del 2,3BPG (2,3 BiFosfoGlicerato) in quantità equimolare all’emoglobina (2mM). In pratica, una molecola di BPG si pone al centro del tetramero in una tasca presente solo in conformazione T, dopodiché i legami con BPG si rompono durante la transizione T-R. Il cambio conformazionale è determinato dall’occupazione di più siti di legame possibili con O₂, che determinerà una bassa affinità per l’Ossigeno: questo decremento dell’affinità è essenziale per l’ossigenazione tissutale (l’ossigeno deve staccarsi dall’emoglobina e diffondere nei tessuti).

Tutto ciò ci porta a concludere che il 2,3 BPG è un regolatore allosterico dell’emoglobina. Questa molecola è indispensabile perché consente il trasferimento dell’Ossigeno dall’emoglobina materna a quella fetale. Ciò accade perché nel sito di legame del BPG si sostituisce S¹⁴³ a His¹⁴³, il che porta a una minore affinità per BPG e una maggiore affinità per l’Ossigeno. Il trasferimento è possibile perché l’affinità dell’emoglobina fetale per l’Ossigeno è più alta di quella dell’emoglobina materna.

Questa differenza ha basi genetiche, in quanto il gene che codifica per l’emoglobina fetale è diverso da quello che codifica per l’emoglobina adulta. Per questo emoglobina materna e fetale sono definite isoforme: sono proteine diverse che svolgono la stessa funzione ma hanno regolazione, struttura e disposizione diversi.

Trasformazioni proteiche

Si tratta molto spesso di modificazioni post-traduzionali, e possono essere di svariati tipi:

• Modifiche a carico del lato ammino-terminale o carbossi-terminale;
• Perdita delle sequenze segnale;
• Modifiche dei singoli amminoacidi;
• Aggiunta di catene laterali di carboidrati: Questo processo è chiamato glicosilazione e può coinvolgere il lato ammino-terminale di residui di Asn (N-glicosilazione), o il lato carbossi-terminale di residui di Ser o Thr (O-glicosilazione). La glicosilazione è riservata a proteine che svolgono il loro ruolo fuori dalla cellula (ad esempio i proteoglicani delle mucose) o per il riconoscimento da parte di specifici recettori.
• Aggiunta di radicali alchilici: Ad esempio il radicale miristoile (dall’acido miristico), utile alle proteine di membrana (ancoraggio proteine G eterotrimeriche).