Biochimica

Biochimica delle membrane biologiche e trasporto molecolare

La biochimica cerca di descrivere le leggi alla base della vita degli organismi viventi, basate sull'unità biologica rappresentata dalla cellula formata da: membrane, nucleo e numerosi organelli. La biochimica descrive le strutture e i meccanismi che governano le funzioni cellulari, scendendo nel più intimo dettaglio per arrivare a vedere quelle che sono le biomolecole.

Membrane biologiche

Le membrane definiscono i confini delle cellule, regolano il traffico delle molecole e dividono lo spazio interno in compartimenti (negli eucarioti), segregando in essi specifici componenti e processi biologici. Esse hanno la caratteristica di essere resistenti e flessibili, ma anche autosigillanti (formazione di vescicole di endocitosi o di esocitosi che non permettono alla membrana di lasciare dei buchi dopo la loro origine, ma di tenerla compatta).

Delimitano dei comparti (citosol, mitocondri…) che contengono una serie di proteine specializzate (enzimi) che insieme collaborano in una specifica funzione o via metabolica cellulare. In generale sono impermeabili alle molecole polari, ma possono essere selettivamente permeabili ad alcuni di loro (Na, K, Ca), permettendo di accumularli all’interno della cellula (K, potenziale di membrana) o in comparti cellulari (Ca, contrazione muscolare), e di rilasciarli per svolgere una determinata funzione cellulare (K, propagazione dell’impulso lungo la membrana; Ca, spostamento della tropomiosina → aggancio miosina).

Proteine specializzate sulle membrane

• Trasportatori e canali: spostano da un lato all’altro della membrana o permettono il passaggio di specifiche molecole cariche o piccoli ioni, che normalmente non la attraverserebbero.
• Recettori: interagiscono con specifici ligandi (ormoni, citochine…). La loro interazione determina una cascata di eventi molecolari a catena che infine produce modificazioni all’interno della cellula (es. insulina, glucagone → attivazione di una specifica via metabolica; citochine, proliferazione cellulare).
• Molecole di adesione: tengono adese le cellule ad una matrice biologica (es. integrine con il collageno).
• Complessi enzimatici (es. la catena di trasporto degli elettroni sulla membrana interna mitocondriale).

Le membrane creano compartimenti che svolgono funzioni specialistiche, permettendo di:

• Separare vie metaboliche altrimenti non compatibili: la biosintesi dei lipidi avviene nel citosol, ma la degradazione dei lipidi avviene nei mitocondri (in caso contrario si innescherebbero cicli futili).
• Produrre proteine modificate (es. glicosilate): la biosintesi delle proteine cellulari avviene nel citosol, ma quelle che debbono essere esportate (secrete o collocate sulla superficie esterna della membrana citoplasmatica) vengono modificate all’interno del reticolo endoplasmatico e dell’apparato di Golgi prima di essere riversate all’esterno della cellula.
• Creare gradienti chimici o elettrici (es. la doppia membrana che riveste i mitocondri crea uno spazio in cui vengono immagazzinati i protoni necessari per la produzione di ATP).

Componenti delle membrane

• Lipidi polari
• Proteine
• Carboidrati (sotto forma di glicoproteine e glicolipidi)

Lipidi polari

I lipidi polari (fosfolipidi) sono anfipatici e quando entrano in contatto con l’acqua si dispongono con la porzione carica a contatto con essa e la porzione idrofobica il più lontano possibile da essa, per formare un monostrato (micelle) o un doppio strato (liposoma). Le micelle sono catene idrofobiche degli acidi grassi sono sequestrate all’interno della sfera, lontano dall’acqua. I liposomi sono i lipidi si dispongono a doppio strato che racchiude una cavità riempita d’acqua; all’interno del doppio strato le catene lipidiche sono protette dall’interazione con l'acqua, mentre le loro teste polari entrano in contatto con essa.

Struttura delle membrane biologiche

La struttura delle membrane biologiche è un modello a mosaico fluido costituito da:

• I fosfolipidi formano una membrana a doppio strato lipidico.
• Le proteine sono immerse o appoggiate ad essa, sono vincolate alla membrana.
• Le proteine e i lipidi sono liberi di muoversi lateralmente nel piano del doppio strato (mosaico fluido), ma il movimento da un foglietto all'altro è assai limitato.
• Gli zuccheri (glicoproteine e lipoproteine) di membrana sono presenti solo sul lato extracellulare.

I costituenti più abbondanti nelle membrane sono i lipidi polari di membrana, in particolar modo colesterolo e fosfolipide. Il fosfolipide è incardinato su una molecola di glicerolo, formata da 3 atomi di C, ciascuno dei quali è incatenato da un gruppo alcolico. Nel fosfolipide a 2 funzioni alcoliche sono incatenate 2 molecole di acido grasso saturo (catena lineare senza doppi legami) o insaturo (catena che presenta insaturazioni, ovvero doppi legami), mentre la terza funzione alcolica lega un gruppo polare rappresentato da un gruppo fosfato che può essere la colina, l’etanolammina oppure la serina. Il fosfolipide quindi è caratterizzato da una testa polare costituita da un gruppo fosfato e code apolari.

Colesterolo

Il colesterolo è una molecola molto simile al fosfolipide infatti presenta le stesse porzioni fondamentali: la testa polare formata da un singolo idrossile, un corpo formato da anelli steroidei ai quali è attaccata una coda apolare. Il colesterolo è presente nel doppio strato lipidico e regola la fluidità della membrana in un ampio intervallo di temperature (una sorta di anticongelante): aumenta la fluidità alle temperature basse e riduce la fluidità alle temperature alte.

Gli organismi viventi cercano di mantenere costante la fluidità delle membrane biologiche al variare della temperatura ambientale anche modificando le catene di acidi grassi nei fosfolipidi. I fosfolipidi presenti sulla membrana sono confinati nel loro strato, quindi non è possibile la diffusione trasversale spontanea, o meglio è molto lenta e quindi non avviene. Tuttavia è possibile che i fosfolipidi passino da uno strato all’altro tramite l’utilizzo di enzimi immersi nel doppio strato lipidico che sfruttano l’energia fornita dall’ATP per portare un fosfolipide dallo strato esterno a quello interno (flippasi) o viceversa (floppasi) oppure che portano all’interno un fosfolipide e un altro all’esterno (scramblasi). Il trasporto dei fosfolipidi su uno dei due foglietti del doppio strato è essenziale per generare curvature della membrana. La fusione tra membrane interessa molti processi cellulari.

Struttura della molecola di ATP

La struttura di una molecola di ATP è formata da una base (adenina) legata a una molecola di zucchero (ribosio) che, a sua volta, è legato a tre molecole di fosfato. La distribuzione dei fosfo- e glicolipidi nel doppio strato è asimmetrica. Nell’apoptosi l’esposizione di fosfatidilserina sul foglietto extracellulare (flopping) indirizza la cellula alla distruzione per morte programmata. Nei trombi le piastrine si possono aggregare per formare il trombo solo dopo esposizione extracellulare di fosfatidilserina.

Proteine di membrana

La membrana è costituita anche da proteine che possono essere definite integrali o periferiche. Le proteine integrali sono strettamente associate al doppio strato lipidico e possono essere rimosse da detergenti e solventi organici che rompono le interazioni idrofobiche. Le proteine periferiche sono associate alla membrana, in contatto con le proteine integrali attraverso legami deboli (interazioni elettrostatiche, legami a H) oppure anfitropiche, in contatto con i lipidi della membrana, anche attraverso legami forti.

Le proteine di membrana legate ai lipidi (anfitropiche) possiedono un legame diretto con i lipidi di membrana (legame covalente) e di solito sono presenti soltanto sul lato citosolico della membrana. Le proteine integrali possono essere legate ad oligosaccaridi. Sono delle proteine di transmembrana con una porzione centrale costituita da aminoacidi fortemente lipofili che permettono alla proteine di restare nel doppio strato lipidico, sono formante da una porzione N-terminale costituita da aminoacidi idrofilici e sullo strato esterno della membrana troviamo sempre aminoacidi idrofilici ai quali risultano essere legati covalentemente dei saccaridi. Solitamente i recettori di membrana si presentano quindi sotto forma di glicoproteine. Le proteine integrali possono avere una o numerose sequenze idrofobiche ad α-elica, lunghe abbastanza (20-25 aminoacidi) da attraversare la membrana.

Trasporto molecolare

Diffusione semplice

Nella diffusione semplice, per soluti apolari, il movimento netto di un soluto elettricamente neutro avviene verso il lato a minore concentrazione, quindi secondo gradiente chimico di concentrazione, fino all’equilibrio. La velocità del movimento transmembrana (indicato dalle frecce) è proporzionale al gradiente di concentrazione. Nella diffusione semplice, per soluti polari, il movimento netto di un soluto elettricamente carico avviene verso il lato a carica opposta, quindi secondo gradiente elettrico, fino all’equilibrio delle cariche.

Canali e trasportatori

Canali: I canali non sono saturabili (se si aprono sono come l’autostrada), consentono il passaggio dei soluti polari secondo gradiente e garantiscono flussi molto elevati (paragonabili alla diffusione libera, sono gallerie scavate nella membrana).

Trasportatori: I trasportatori legano soluti polari e li veicolano attraverso la membrana (fanno il lavoro del boy-scout che accompagna la vecchietta sulle strisce pedonali) e sono saturabili (entra una sola persona per volta). I trasportatori sono importanti per il metabolismo.

Classi generali di trasportatori

• Uniporto: consentono al soluto di attraversare la membrana in un solo senso.
• Simporto: consentono l’entrata simultanea di due tipi differenti di soluto.
• Antiporto: consentono il passaggio di soluti diversi in direzione opposta.

A loro volta ognuno di loro si suddivide in:

• Trasportatori passivi (no ATP): diffusione soluti a favore di gradiente.
• Trasportatori attivi (sì ATP)(primari e secondari): diffusione soluti contro gradiente.

Trasportatore passivo

Un esempio di trasportatore passivo è lo scambiatore cloruro-bicarbonato presente sulla membrana eritrocitaria. Questo sistema di antiporto (secondo gradiente di concentrazione) permette l'entrata di ioni Cl e l'uscita di HCO₃^-. La sua attività è importante perché acidifica il citosol del globulo rosso che ha un effetto sul rilascio di O₂ dall’emoglobina. Un altro esempio è l’ATP-sintasi che sfrutta gradienti protonici generati all’interno della doppia membrana che avvolge il mitocondrio per ricaricare l’ADP trasformandola in ATP. Ogni 4 H⁺ che passano viene prodotta una molecola di ATP.

Il trasportatore del glucosio nelle fibre muscolari è un ulteriore esempio di trasportatore passivo. Sulla superficie cellulare, GLUT4 permette la diffusione facilitata del glucosio circolante lungo il suo gradiente di concentrazione in cellule muscolari e adipose. L’insulina è in grado di stimolare, grazie al proprio recettore, una cascata di segnali che determinano il trasporto di vescicole presenti nel citoplasma della cellula muscolare che sulla superficie presentano numerosi trasportatori per il glucosio. Queste vescicole vengono indirizzate a fondersi con la membrana muscolare portando nuovi canali del glucosio sulla membrana muscolare. La fusione è indotta anche dalla pratica sportiva.

Trasportatore attivo

Il trasportatore attivo consente il trasporto di una molecola di soluto contro gradiente di concentrazione con utilizzo di energia non essendo un processo spontaneo. Si definisce trasportatore primario una proteina in grado di far passare il soluto e di scindere l’ATP in ADP, perciò possiede anche una componente ATPasica. Si definisce trasportatore secondario un trasportatore primario abbinato ad un trasportatore passivo, in un simporto.

Un esempio di trasportatore attivo primario è la pompa ATPasica Na⁺/K⁺ che permette lo scambio tra K⁺ e Na⁺ contro gradiente creando un gradiente elettrochimico del Na⁺ e del K⁺ che provoca la polarizzazione della membrana. Mentre 3 molecole di Na⁺ escono dalla cellula, al contempo entrano in essa 2 molecole di K⁺. L’attività di questa pompa si definisce elettrogenica perché è in grado di produrre sulla membrana, un potenziale elettrico, caratterizzato da una polarità positiva sul lato esterno e, di converso, una polarità negativa sul lato interno. Quando la cellula muore, il potenziale di membrana si scarica e viene depauperato, quindi le cellule vive richiedono una spesa energetica anche soltanto per mantenere la differenza del potenziale di membrana.

Un esempio di trasportatore attivo secondario è rappresentato dalla captazione del lattosio in E. coli. Il lattosio entra all’interno delle cellule tramite l’utilizzo di una pompa protonica che rappresenta un trasportatore primario con attività ATPasica. In questo modo il lattosio entra nella cellula e in contemporanea entra anche il protone secondo gradiente. Esistono numerosi tipi di trasportatori del glucosio. Nel rene, il trasporto attivo secondario del glucosio avviene tramite il GLUT2 che cotrasporta glucosio e Na⁺ (simporto): il Na⁺ (uscito grazie alla pompa Na⁺/K⁺ ATPasica) rientra nelle cellule secondo gradiente e cotrasporta il glucosio contro gradiente.

I canali ionici sono più veloci dei trasportatori, non sono saturabili, sono aperti o chiusi in risposta a eventi cellulari (ligandi, differenza di potenziale di membrana) → Es. Recettore canale dell’acetilcolina. Inoltre i canali ionici difettosi possono causare patologie.

Mioglobina ed emoglobina

Mioglobina

La mioglobina è una proteina muscolare globulare con una struttura terziaria. La mioglobina è una proteina che lega l’O₂ e ne facilita l’accumulo nelle cellule muscolari a riposo e il suo rilascio rapido quando si contraggono. È costituita da una catena di 153 aminoacidi e da un gruppo EME (ferroporfirinico) posizionato all’interno di una tasca idrofobica e agganciato alla catena laterale di una particolare istidina (His) presente nella catena proteica, mentre nell’altro lato troviamo un’altra His importante per il meccanismo di captazione, cioè per il meccanismo attraverso il quale l’O₂ resta legato al gruppo EME.

Lo scheletro della mioglobina è costituito da 8 segmenti compatti di α-eliche destrorse (78% della molecola) interrotte da ripiegamenti. La maggior parte degli aminoacidi idrofobici si trova all’interno della molecola (lontano dall’acqua). La maggior parte degli aminoacidi polari si trovano alla superficie della molecola tranne 2 His, molto importanti per il meccanismo di cattura dell’O₂.

Gruppo EME

Il gruppo EME è una protoporfirina presente in: mioglobina, emoglobina e citocromi. Il Fe²⁺ forma 6 legami di coordinazione (in rosso), di cui 4 con gli atomi di N dell’anello tetrapirrolico della protoporfirina, che sono disposti nel piano dell’anello; gli altri 2 sono perpendicolari ad esso (uno dei due lega l’N di un’His, mentre l’altro lega una molecola di O₂).

L’His fa parte degli aminoacidi idrofilici, ma nonostante questo sono posti all’interno della tasca idrofobica e una di queste permette al gruppo EME di restare bloccato, tramite un legame covalente. Nella tasca idrofobica costituendo il gruppo prostetico della mioglobina. Il gruppo EME è infossato all’interno della struttura globulare della proteina in una tasca idrofobica che impedisce l’accesso alle molecole di acqua. In questo modo il Fe non ha contatti con l’acqua che lo ossiderebbe a Fe³⁺, una valenza che non è in grado di legare l’O₂.

Nella mioglobina (ma anche nell’Hb) l’O₂ si lega al Fe, formando un legame angolato rispetto al piano dell’EME e instabile. Il CO (monossido di carbonio) si lega al Fe del gruppo EME all’interno della tasca mioglobinica con una efficienza 200 volte superiore all’O₂ e irreversibilmente. Un legame a H con l’His (E7) stabilizza il legame dell’O₂ con il Fe del gruppo EME.

La mioglobina è una proteina di accumulo dell’O₂ all’interno dei muscoli, dove è presente una pressione (pO₂), in condizioni di riposo, pari a 4 kPa. Dal punto di vista biochimico è possibile verificare la capacità di una proteina di captare l’O₂ utilizzando semplici metodi che impegnano degli spettrofotometri. La curva di legame o di saturazione dell’O₂ alla mioglobina è un’iperbole rettangolare. Il legame della Mb all’O₂ è insensibile a piccole variazioni della [O₂] disciolto (curva iperbolica). Quando la pO₂ è pari a 4 kPa, quasi il 100% di Mb è satura di O₂. Funziona bene per il deposito, trattiene cioè l’O₂ e lo cede, per la respirazione cellulare (catabolismo ossidativo), solo quando la [O₂] citoplasmatica è molto bassa. La frazione di siti di legame mioglobinici occupati dall’O₂ (θ) è riportata in funzione della pO₂, pressione parziale di O₂ presente nell’aria in contatto con la soluzione → P₅₀ = 0.26 kPa. Quindi la mioglobina cede la metà dell’O₂ legato a 0.26 kPa pO₂.

Emoglobina

L’emoglobina è una proteina eritrocitaria trasportatrice di O₂. È satura in O₂ al 98% nel sangue arterioso quando l’emoglobina raggiunge i polmoni, poi raggiunge i tessuti rilasciando circa il 38% dell’O₂, ma il 60% di O₂ legato all’emoglobina entra nel sangue venoso.