Biochimica 1

Biochimica modulo 1

Date: September 21, 2023

University of Trento
Biomolecular Science and Technology
Via Sommarive 9, 38123
Povo (TN), Italy

Filosofia del corso

La biochimica ha fondamenti strutturali:

• La struttura delle biomolecole ha elementi in comune.
• Questi elementi interagiscono insieme con differenti tipi di legame e disposizioni. Questi legami conferiscono caratteristiche fisiche e biochimiche alle molecole che stiamo studiando.
• Gli elementi e i legami costituiscono la biodiversità molecolare.

La biochimica caratterizza e sfrutta la biodiversità molecolare.

Quali sono i soggetti di studio della biochimica?

• Microbiologiaàl’evoluzione delle colonie microbiche; i microorganismi nella salute umana, comunicazione chimica tra i microrganismi.
• Biologia cellulareàmeccanismi di mantenimento degli organelli, duplicazione cellulare, meccanismi di permeabilità cellulare, comunicazione cellulare, funzione e disfunzione piastrinica (coagulazione del sangue), compartimento nucleare e sottocompartimenti per gli acidi nucleici, formazione di tumori e ovogenesi.
• Trasduzione del segnaleàinterazioni intercellulari, replicazione del DNA, danno al DNA, instabilità del genoma, segnalazione transmembrana mediante GPCR, funzioni ormonali e trasporto, interazioni membrana-citoscheletro, meccanismi molecolari del cancro.
• L’energia di generazione/consumo.
• Regolazione dell’espressione genicaàepigenetica e regolazione della cromatina, alterazioni del DNA e fase S, esportazione nucleare, localizzazione ed efficienza traduzionale degli mRNA, trascrittomica spaziale.
• Struttura e dinamicità delle proteineàRipiegamento e progettazione delle proteine, studi strutturali di proteine disordinate, omeostasi e aggregazione delle proteine, complessi anticorpo-antigene Relazione attività strutturale (SAR).
• Meccanismi di trasporto e membraneàstruttura peptidica e proteica nelle membrane, determinanti strutturali delle funzioni proteiche, reti di interatomi proteina-proteina e proteina-DNA/RNA.
• Traffico vescicolare.
• Scoperta delle droghe e medicina molecolareàModelli per la tossicità o la rigenerazione dei tessuti, patogenesi delle tossine, farmaci antitumorali e meccanismo d'azione, saggi di screening ad alto rendimento, ottimizzazione dei farmaci.
• Attività enzimaticheàInterazioni proteina-substrato, enzimologia e cinetica, termodinamica e metabolismo.
• Biologia computazionaleàIndagini teoriche e computazionali sul ripiegamento, le interazioni e l'evoluzione delle proteine, docking molecolare (come le molecole si uniscono), analisi di big-data (Trascrittomica, Genomica, Proteomica, Metabolomica, Lipidomica, ecc.).

Fondamenti di biochimica

La biochimica analizza i meccanismi e le interazioni tra molecole, chiamando in causa i vari ambiti ai quali si applica:

• Biologia cellulare.
• Chimica.
• Fisica, perché l’energia è alla base della conoscenza della cinetica delle reazioni enzimatiche.
• Genetica, l’eredità e il patrimonio genetico e proteico dei vari organismi è molto simile ma con diverse forme di specializzazione (le cellule viventi hanno in comune un antenato LUCA e la necessità di ricavare energia).
• Evoluzione 2

Le proprietà di un organismo sono un alto livello di complessità chimica macroscopica e microscopica, i sistemi per estrarre, trasformare e usare l’energia e le funzioni definite di specifici componenti.

Fondamenti di biologia cellulare

La diversità tra cellula eucariotica e procariotica dipende dalla presenza o assenza di regioni macroscopiche, come il nucleo e tutta una serie di organelli che ne derivano (come il citoscheletro) e dalle dimensioni molto diverse: 1.5 micron per i batteri e fino a 50 micron per la cellula eucariotica.

Nonostante questo, entrambe comunicano con l’ambiente esterno e con le cellule adiacenti, soprattutto secernendo vescicole extra-cellulari, facendo sharing di materiale biologico, come lipidi, metaboliti, acidi nucleici e proteine.

La biologia cellulare descrive e quantifica le differenze e le somiglianze tra questi due tipi di cellule, analizzando particolari compartimenti subcellulari come:

• Nucleo, che comunica con il citoplasma attraverso lo scambio di RNA e proteine.
• Reticolo endoplasmatico ruvido e liscio.
• Lisosomi e perossisomi, macchine che incapsulano materiale che potrebbe essere nocivo per le cellule.
• Con enzimi specifici e differenziati.
• Mitocondri Si ha un’organizzazione gerarchica i cui si possono trovare diversi complessi molecolari. Zoomando si possono osservare le biomolecole e addirittura i monomeri.

Struttura gerarchica

• Atomo.
• Molecola.
• Macromolecola.
• Organello.
• Cellula.
• Tessuto.
• Organo.
• Sistema di organi.

A parte l’atomo, è stato sviluppato un modulo molto efficace che consente di studiare potenzialmente tutti i livelli fino alla molecola. Questo sistema è l’ultracentrifugazione differenziale, che viene utilizzata per separare organelli e altre particelle subcellulari in base alla loro velocità di sedimentazione (coefficiente di sedimentazione) e alla loro dimensione. Consente di separarle, anche se non in modo puro. Si possono distinguere diversi range di applicazione che consente di separare elementi diversi, per mezzo dell’applicazione di una velocità centrifuga fino a 300.000 G).

GOF=rispetto alla forza di gravità. 3

Lisare le cellule è fondamentale per denaturare le proteine o rompere le interazioni tra macromolecole. L’omogenato tessutale si ottiene prendendo un pezzo di tessuto, inserendo della tripsina che distrugge gli elementi più superficiali della matrice. Si ottiene questa “pappa” in cui sono contenute diverse macromolecole. Il lisato è fatto girare a 1.000 giri per 10 min, ottenendo un pellet che contiene cellule, nuclei, citoscheletri e membrane. Il surnatante è sottoposto a ultracentrifugazione (20.000 giri per 20 minuti) e si ottengono frammenti di mitocondri, lisosomi e perossisomi. Dopo ulteriore centrifugazione del surnatante (80.000 giri per 1 ora) si ottiene un pellet contenente microsomi, ovvero frammenti di reticolo endoplasmatico, e piccole vescicole. Infine, il surnatante è sottoposto a 150.000 per 3 ore e si ottiene un pellet che presenta ribosomi e grandi macromolecole. Si chiama differenziale perché di volta in volta il surnatante è sottoposto a progressiva centrifugazione. Nessuno di questi pellet avrà un purificato, quindi si avranno pezzi di lipidi, proteine ecc. Andando a lisare i nuclei si ottengono frammenti di RNA e di DNA. Si parla quindi di arricchimento.

Fondamenti di chimica

Le biomolecole sono una varietà di carbonio con diversi legami e gruppi funzionali. Questo è il principio del fondamento chimico. La quantità e la qualità degli elementi determina la natura delle biomolecole. Il carbonio spicca in quantità e in qualità. Il carbonio ha una grande versatilità perché: si può legare con diversi elementi con quattro legami per riempire i propri orbitali;

• Può formare legami singoli, doppi o tripli, in particolare con H, O, N e sé stesso.
• Ha diversi angoli di legame.
• Ha possibilità di rotazione con riarrangiamenti conformazionali per avere energia libera minore; lega diversi gruppi funzionali con diversi tipi di interazioni.
• Forma molecole a diversa massa molecolare.

La disposizione con la quale questi legami vengono formati cambia e richiedono energie diverse per formarsi e rompersi. L’elemento con il quale il carbonio si lega ha una distanza differente a seconda dell’elettronegatività dell’elemento in questione.

L’effetto della rotazione tra due elementi legati

I diversi legami che il carbonio può instaurare determinano un differente assetto/disposizione nello spazio. L’atomo centrale, per esempio nella conformazione tetraedrica con angoli di legame di 109,5°, è leggermente spostato dal centro e questo determina la formazione di un dipolo che permette interazioni con atomi vicini. Inoltre, c’è la possibilità di rotazione tenute in asse attraverso il legame covalente principale. Nel doppio legame, invece, la struttura è planare.

Nell’asse X del grafico si hanno gli angoli di torsione, sull’asse Y l’energia potenziale. Le onde indicano l’accumulo di energia potenziale specifico associata alla distanza tra le molecole, determinata dai legami. Quando si hanno due molecole distanti tra loro, l’energia libera è più negativa e quindi anche l’energia potenziale è più negativa. Questo significa che ho bisogno di meno energia per formare la conformazione sfalsata. Questa rotazione tra 4 le due conformazioni avviene milioni di volte al secondo; quindi, è impossibile separare la forma sfalsata da quella eclissata.

Il peso molecolare e la massa molecolare

Il peso molecolare di una sostanza è definito come il rapporto tra la massa di una molecola di quella sostanza e un dodicesimo della massa di un atomo di carbonio-12 (12C). Poiché si tratta di un rapporto, è adimensionale. 23

La massa molecolare (m) è la massa di una mole (6,02x10 particelle) di un elemento (ione). m è espresso in dalton (abbreviato Da). Un dalton equivale a un dodicesimo della massa di un atomo di carbonio-12; un kilodalton (kDa) è 1.000 dalton; un megadalton (MDa) equivale a 1 milione di dalton.

Il tipo di legame

Composizione chimica della cellula

Analizzando il contenuto di una cellula, la maggior parte è rappresentata da acqua (72%), seguono poi proteine (15%), acidi nucleici (7%), polisaccaridi (3%), lipidi (2%) e ioni inorganici (1%).5

Stereochimica

I legami covalenti e i gruppi funzionali di una biomolecola sono ovviamente fondamentali per la sua funzione, ma lo sono anche la disposizione degli atomi costituenti la molecola nello spazio tridimensionale. I composti contenenti carbonio esistono comunemente come stereoisomeri, molecole con gli stessi legami chimici e la stessa formula chimica ma diversa configurazione, la disposizione spaziale fissa degli atomi. Le interazioni tra le biomolecole sono stereospecifiche e richiedono configurazioni specifiche nelle molecole interagenti.

Quando abbiamo singoli legami che consentono un movimento di rotazione si hanno stereoisomeri, molecole con gli stessi legami chimici e la stessa formula chimica ma con diverse configurazioni (il posizionamento degli atomi nello spazio).

In questo caso si ha un centro chirale, un atomo di carbonio con quattro diversi sostituenti che lo rendono asimmetrico. Gli stereoisomeri che sono immagini speculari sono chiamati enantiomeri, mentre coppie di stereoisomeri che non sono immagini speculari sono detti diastereoisomeri.

La conformazione è un parametro che non dipende dagli elementi chimici presenti nella molecola ma dalla configurazione spaziale degli elementi, sulla base dei centri chirali, dal numero e della qualità dei sostituenti e della possibile rotazione attorno ai singoli legami.

La configurazione è conferita dalla presenza di (1) doppi legami, attorno ai quali c'è poca o nessuna libertà di rotazione, o (2) centri chirali, attorno ai quali i gruppi sostituenti sono disposti secondo un orientamento specifico. Questi composti sono isomeri geometrici o isomeri cis-trans.

Un atomo di carbonio con quattro sostituenti diversi si dice asimmetrico e i carboni asimmetrici sono chiamati centri chirali.

Una molecola con un solo carbonio chirale può avere due stereoisomeri; quando sono presenti due o più (n) carboni chirali, possono esserci 2n stereoisomeri. Gli stereoisomeri che sono l’uno immagine speculare dell’altro sono detti enantiomeri. Le coppie di stereoisomeri che non sono immagini speculari l’una dell’altra sono chiamate diastereoisomeri.

Gli isomeri hanno proprietà biofisiche diverse

Pasteur si è accorto che i cristalli dell’acido tartarico erano uno speculare rispetto all’altro, anche sottoponendoli ad una diffrazione con laser incidente, con un prisma che scompone un raggio incidente.

Il profilo spettroscopico si è rilevato abbondante al 50% in natura; quindi, si è reso conto che in natura possono esistere, per alcuni composti, dei conformeri rotazionali. 6

Soltanto uno dei conformeri è biologicamente attivo e l’attività biologica dipende da quale substrato viene riconosciuto dall’enzima e da quale è favorito energeticamente.

Proprio per questo motivo avviene il passaggio da uno stereoisomero all’altro, dal momento che la molecola tende sempre al livello più basso di energia per essere più stabile.

Fondamenti fisici

Uno degli obiettivi della biochimica è comprendere, in termini quantitativi e chimici, i mezzi attraverso i quali l'energia viene estratta, immagazzinata e utilizzata nelle cellule viventi. È collegato alle leggi della termodinamica.

Un organismo vivente è un sistema aperto, perché le reazioni chimiche trasformando una specie in un’altra richiedono energia per avvenire e per essere catalizzate.

Il concetto di energia libera

La teoria dei cambiamenti di energia durante le reazioni chimiche ha mostrato che il contenuto di energia libera, G, di qualsiasi sistema chiuso può essere definito in termini di tre quantità: entalpia, H, che riflette il numero e il tipo di legami; entropia, S; e la temperatura assoluta, T (in Kelvin). La definizione di energia libera in G = H – TS. Quando una reazione chimica avviene a temperatura DG, DH, costante, la variazione di energia libera, è determinata dalla variazione di entalpia, che riflette il tipo e il numero di legami chimici e interazioni non covalenti spezzate e formate, e dalla variazione DS, di entropia, descrivendo il cambiamento nella casualità del sistema: Δ = Δ − T · Δ

Reazioni che richiedono energia: endoergoniche.

Reazioni che liberano energia: esoergoniche.

DHàdipende dalla qualità delle molecole presenti nel sistema. H è maggiore quando il numero dei legami tra le molecole è relativamente alto.

Tàè la temperatura del sistema. Il movimento delle molecole è maggiore quando T aumenta.

DSàè il grado del disordine e dipende dalle concentrazioni molecolari. S è maggiore quando le molecole sono lontane tra di loro.

Tutti sistemi tendono all’equilibrio seguendo questa legge della dinamica.

La formula di Gibbs permette di quantificare uno stato energetico intrinseco delle molecole come variazione di energia.

ΔG<0 reazione favorevole e spontanea.

ΔG>0 reazione meno favorevole.

Come si applica questo nelle reazioni chimiche? Nei sistemi chiusi le reazioni chimiche procedono spontaneamente fino al raggiungimento dell'equilibrio. Quando un sistema è all'equilibrio, la velocità di formazione del prodotto è esattamente uguale alla velocità con cui il prodotto viene convertito in reagente. Pertanto, non vi è alcuna variazione netta nella concentrazione di reagenti e prodotti. La variazione di energia quando il sistema si sposta dal suo stato iniziale all'equilibrio, senza variazioni di temperatura o pressione, è data dalla variazione di energia libera, ΔG.

L’equilibrio di una soluzione è un concetto termodinamico: è un rapporto che ho fra prodotti e reagenti. La costante di equilibrio è un valore che indica quando si è raggiunto l’equilibrio. Se ho un sistema in cui la velocità della reazione è influenzata dalla qualità degli elementi e l’entropia, l’equilibrio lo posso misurare partire dalla concentrazione dei reagenti e dei prodotti.7

A livello di reazioni chimiche non esistono reazioni unidirezionali, ma le reazioni sono praticamente tutte all’equilibrio perché avvengono reazioni enzimatiche che catalizzano il fatto che una specie venga trasformata in un’altra.

L’equilibrio viene definito come: # $[] · []!" !" =!" % &[] · []!" !"

Keq >> 1: La miscela contiene principalmente prodotti.

Keq << 1: La miscela contiene principalmente reagenti.

Un intervento di agenti esterni comporta il passaggio da una specie all’altra e ciò dipende dalla concentrazione dei substrati.

Questo ci permette di definire la costante di equilibrio Keq. Le migliaia di reazioni catalizzate da enzimi nelle cellule sono organizzate funzionalmente in molte sequenze di reazioni consecutive, dette vie metaboliche, in cui il prodotto di una reazione diventa il reagente di quella successiva.

Le reazioni possono prendere il nome di catabolismo, se sono reazioni degradative di prodotti organici in prodotti finali semplici per ottenere energia, o di anabolismo, se convertono i precursori in molecole più grandi e complesse, tramite reazioni di sintesi.

Fondamenti di genetica ed evoluzionistica

Si basa sul fatto che l’informazione è ereditaria ed è veicolata solo dal DNA, che si basa sulla replicazione semiconservativa.

Il DNA, con l’ausilio di alcune proteine (istoni e nucleosomi), è impacchettato in regioni eterocromatiche, che diventano eucromatiche quando si effettua la trascrizione in interfase, mentre si impacchettano ulteriormente in mitosi per dividere correttamente il materiale genetico.

La variabilità e l’evoluzione sono causate dal fatto che ogni volta che il DNA effettua una replicazione semiconservativa, per fattori intrinseci o estrinsechi, av