Batteriologia e virologia 2

Crescita batterica

La crescita batterica è influenzata da diversi fattori.

Fattori nutritizi

La maggior parte dei batteri utilizza i fattori nutritizi sia come fonte di energia, sia per il metabolismo plastico (= per la produzione di macromolecole necessarie alla sua vita). L'eccezione sono i batteri fotosintetici che trasformano l'energia radiante in energia chimica - non hanno bisogno di utilizzare fattori nutritizi per produrre energia ma solamente per la produzione di macromolecole.

I batteri possono essere classificati in base alla fonte di carbonio utilizzata e al modo con cui producono energia:

• Batteri autotrofi: Utilizzano CO₂ come fonte di carbonio. Si dividono in:
  • Fotoautotrofi: In grado di effettuare fotosintesi.
  • Chemioautotrofi: Necessitano di reazioni chimiche per generare energia.
• Batteri eterotrofi: Utilizzano composti organici. Si dividono in:
  • Fotoeterotrofi: Utilizzano l'energia radiante per degradare i composti organici.
  • Chemioeterotrofi: Utilizzano l'energia derivante dal metabolismo di macromolecole. I batteri di interesse medico appartengono tutti a questo gruppo.

I microrganismi possono essere anche suddivisi in:

• Batteri saprofiti: Si riproducono su materiale morto.
• Batteri parassiti obbligati: Si riproducono su cellule vive, come Rickettsiae, Chlamydiae e virus. Ai parassiti obbligati mancano alcuni enzimi fondamentali per la loro replicazione e quindi devono utilizzare quelli delle cellule.

Oltre al carbonio, i microrganismi necessitano di altre molecole per il proprio metabolismo e riproduzione come idrogeno, ossigeno, azoto, fosforo, zolfo e metalli. Se l'obiettivo è quello di coltivare in vitro dei batteri, è fondamentale assicurarsi di fornire tutti questi fattori nutritizi.

Terreni di coltura

I motivi per cui si fanno crescere dei batteri in laboratorio sono molteplici: osservare come inducono malattia, capirne il meccanismo d'azione o la patogenicità. L'ingegneria genetica consente di produrre proteine, farmaci e sostanze utili. Un motivo importante per la professione del veterinario è sicuramente quello di isolare, identificare e contrastare l'agente patogeno di una determinata patologia.

Terreni base

Per far crescere i batteri in vitro è necessario fornire loro le materie nutritizie adeguate. Molti batteri crescono sul terreno minimo, cioè costituito da:

• Acqua: Con terreni privi di acqua i batteri non sopravvivono.
• Glucosio: Utilizzato come fonte di carbonio.
• Solfato di ammonio: Utilizzato come fonte di azoto.
• Altri sali minerali.

I batteri di interesse medico necessitano di terreni più complessi, arricchiti con specifici fattori di crescita come: basi azotate, aminoacidi e vitamine. Sono quei componenti che i batteri non riescono a sintetizzare ex novo, ma devono trovare nell'ambiente in cui si trovano. I primi terreni sviluppati che contenevano tutti questi elementi furono:

• Brodo di carne: Si metteva a bollire la carne e le cellule presenti nel muscolo, andando incontro a morte, rilasciavano il proprio contenuto arricchendo il brodo.
• Brodo nutritivo: Costituito da acqua, cloruro di sodio, estratto di carne e peptone = è un derivato dalla digestione parziale di proteine animali e vegetali. Il brodo doveva essere mantenuto ad un pH neutro uguale a 7.

Questi due terreni erano liquidi, ma molto spesso è utile far crescere i microrganismi su terreni solidi per poter osservare la formazione e la crescita di singole colonie, che può darci un'idea di che tipo di organismo si tratta. Uno dei terreni solidi più semplici è il brodo nutritivo a cui viene aggiunto agar in percentuale del 1,5-2%, ottenendo quello che viene detto agar nutritivo. L'agar è un polimero che si trova sotto forma di polvere che quando viene scaldato si scioglie, mentre quando la temperatura si abbassa nuovamente, solidifica consentendo quindi la solidificazione di un terreno. È molto importante dosare la concentrazione di agar, perché se ne viene aggiunto troppo viene sequestrata troppa acqua e quindi i batteri non crescono dato che non riescono ad utilizzarla. I terreni "agarizzati" non consentono il movimento dei batteri flagellati.

Alcuni batteri patogeni sono più esigenti e necessitano ulteriori fonti nutritizie: possono richiedere l'aggiunta di glucosio o estratto di lievito al brodo nutritivo o all'agar nutritivo.

Terreni speciali

Per le indagini batteriologiche sono disponibili differenti terreni che hanno finalità differenti.

• Terreni di trasporto: Il prelievo non viene fatto nello stesso luogo in cui vengono svolte le analisi, quindi il campione deve essere trasportato e mantenuto in condizioni idonee dal momento in cui viene prelevato fino all'arrivo in laboratorio. I terreni di trasporto hanno la finalità di mantenere vitali tutti i microrganismi presenti nel campione senza alterare le percentuali delle varie popolazioni microbiche. Il rischio è che se un batterio è poco rappresentato ma è quello responsabile della sintomatologia, le altre specie microbiche potrebbero prendere il sopravvento e inibire proprio quel microrganismo impedendo così una diagnosi corretta. A tale scopo, i terreni sono costituiti da soluzioni saline tamponate, che impediscono la variazione troppo marcata del pH e non consentono la replicazione dei batteri. Se c'è il sospetto di presenza di batteri anaerobi bisogna assicurare l'assenza di O₂.
• Terreni ricchi: Agar sangue e agar-cioccolato (consentono la crescita di quasi tutti i patogeni). Uno dei terreni molto utilizzati in diagnostica è l'agar sangue - si aggiunge all'agar nutritivo il sangue defibrinato. Il sangue contiene infatti tutti gli elementi necessari per la crescita di microrganismi che infettano un animale ospite, risultando quindi un terreno ottimale. Il sangue viene prelevato da un animale donatore (solitamente bovini o pecore) e si mette in una beuta contenente una grande quantità di sferette di vetro che si tengono in agitazione per consentire la defibrinazione (viene privato della fibrina). Il sangue rimane così scoagulato. Viene poi aggiunto dell'agar, ottenendo così l'agar sangue. Per crescere, alcuni patogeni (come il Neisseria sp.) necessitano la lisi dei globuli rossi, che viene effettuata tramite il calore. Di conseguenza vengono liberate ulteriori sostanze nutritizie ottenendo l'agar-cioccolato.
• Terreni di arricchimento: Sono in genere terreni liquidi e consentono la crescita selettiva di un particolare batterio. Tra questi c'è il brodo di selenite per la crescita delle salmonelle e delle shigelle presenti in campioni fecali. I campioni fecali sono ricchi di specie batteriche e alcune di queste riescono a replicarsi e crescere più facilmente rispetto ad altre. Se non si mettessero questi campioni in terreni particolari, la flora microbica normale potrebbe prevalere e impedire la crescita di altre specie fondamentali per una diagnosi corretta.
• Terreni selettivi: Sono simili ai terreni di arricchimento, ma sono solidi. Inibiscono la crescita di alcuni batteri ed essendo solidi permettono di isolare la specie batterica che riesce a crescere su quel tipo di terreno. Tra questi vi è l'agar-MacConkey, arricchito di sali biliari che inibisce la crescita dei Gram-positivi. Il terreno MSA (Mannitol Salt Agar) che consente solo la crescita degli stafilococchi.
• Terreni differenziali: Consentono di distinguere microrganismi differenti che crescono sullo stesso terreno, perché contengono dei coloranti che durante la crescita batterica possono conferire un colore particolare alle colonie batteriche. Tra questi si ha l'agar-MacConkey - consente di differenziare quei batteri che sono in grado di fermentare il lattosio. I batteri che fermentano il lattosio acidificano il terreno e le colonie diventano fucsia, mentre gli altri batteri restano incolori. Anche l'agar-sangue è considerato un terreno differenziale, poiché se vengono seminati dei batteri emolitici si potrà vedere un cambiamento del terreno al di sotto delle colonie. I batteri (streptococchi alpha o beta emolitici per esempio) possono compiere diversi tipi di emolisi:

• Alpha: Lisi parziale dei globuli rossi - il terreno diventerà più chiaro.
• Beta: Lisi completa - il terreno da rosso diventerà trasparente.
• Gamma: L'emolisi non avviene - le colonie crescono e il terreno rimane inalterato.

Si ha poi il terreno di Baiard e Parker, il quale consente di visualizzare le colonie di S. aureus perché crescono nerastre con un alone chiaro per la presenza della lecitinasi.

Terreni liquidi

• Agar sangue
• Agar cioccolato
• Agar MacConkey - le colonie fucsia sono quelle dei batteri in grado di fermentare il lattosio.

Fattori ambientali

Temperatura

Tutti i batteri crescono in uno specifico range di temperatura dove il loro optimum (temperatura ottimale) è vicino alla soglia superiore. Questo perché gli enzimi, che sono di natura proteica, funzionano meglio a una determinata temperatura. Le temperature più alte favoriscono generalmente l'attività enzimatica, oltre una certa soglia però gli enzimi vengono inattivati e denaturati.

In base al range ottimale di crescita dei batteri possiamo classificarli in 3 categorie:

• Psicrofili (freddo): Optimum a 15-20°C, (alcuni batteri riescono a crescere anche a temperature inferiori, come -8°C, ossia batteri che vivono negli ambienti artici).
• Mesofili: Optimum a 20-40°C, sono tutti quei batteri patogeni per uomo e animali per la loro temperatura corporea compresa nel range - di interesse medico.
• Termofili: Optimum sopra i 40°C, ritrovati in acque termali o geyser dove le temperature arrivano fino a 90/250°C). Hanno proteine termostabili, cioè che non si degradano ad elevate temperature. È proprio da essi che viene isolata una polimerasi e che viene utilizzata in PCR.

La refrigerazione o congelamento dei batteri ne arresta la crescita, ma non li uccide.

Ossigeno

L'O₂ è fondamentale per i processi di respirazione, ma i batteri che non lo utilizzano come fonte di energia (fermentazione) possono farne a meno. Sulla base della necessità di ossigeno i batteri si possono classificare in:

• Aerobi